宋 建 戈 偉 劉 梁

武漢大學人民醫(yī)院腫瘤Ⅱ科，湖北武漢 430060

子宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，手術和放療作為局部治療不能控制子宮頸癌的亞臨床病灶，導致中、晚期子宮頸癌的治療效果較差，而化療作用于全身組織器官殺滅腫瘤，通過特殊的給藥方式還可以提高藥物的局部濃度，以順鉑為基礎的聯(lián)合化療具有重要的抗宮頸癌活性[1-2]，有報道單獨使用其反應率達23%～50%[2-3]，順鉑作為細胞周期非特異性抗癌藥物[4]，對腫瘤細胞的抑制作用較強，但是毒副作用較大。 金水鮮作為國家自主研發(fā)的中藥，承合傳統(tǒng)的中醫(yī)扶正蕩邪理論，經濟且低毒，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)金水鮮凍干粉能夠增強對鉑類藥物敏感的肺癌細胞的增殖抑制和促進細胞凋亡[5-6]，是否同樣會增強對鉑類藥物敏感的宮頸癌細胞的殺傷作用不得而知，因此本研究聯(lián)合使用金水鮮凍干粉以及順鉑觀察對宮頸癌細胞產生的生物學影響，以分析其是否對宮頸癌細胞化療效果有增強作用，為將來臨床的聯(lián)合用藥奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株及試劑

人源宮頸癌C-33A 細胞株：購自美國ATCC。 臨床用金水鮮凍干粉（北京建生藥業(yè)有限公司惠贈，批號：20140821），分裝成濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL的藥物懸液。 取0.3 mg 順鉑（云南生物谷藥業(yè)股份有限公司， 批號：H39021357） 溶解于0.9%氯化鈉溶液10 mL 中，配成終濃度30 μg/mL 溶液。 主要實驗試劑有RPMll640 培養(yǎng)液 （GIBCO）、 胎牛血清（GIBCO）、CCK-8 試劑盒 （北京世紀康為世紀生物科技有限公司）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術研究所，C230）、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）單抗（Santa Cruz 公司，美國）、p21 一抗（Santa Cruz 公司，美國）、p53 一抗（Santa Cruz 公司，美國）、HRP-羊抗兔IgG（Santa Cruz 公司，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 宮頸癌C-33A 細胞培養(yǎng)于含10%FBS（胎牛血清）的RPMI l640 培養(yǎng)液，置于CO2培養(yǎng)箱，37℃靜置培養(yǎng)， 細胞培養(yǎng)2～3 d 后換液，5～7 d 后進行傳代， 用培養(yǎng)液將細胞數(shù)調整為實驗所需密度，向6 cm 培養(yǎng)皿中加入5 mL 完全培養(yǎng)基， 細胞傳代時向管中加入80 μL 臺盼藍溶液，顯微鏡下細胞計數(shù)板計數(shù)，同時判斷細胞密度及存活率，細胞狀態(tài)處于對數(shù)生長期時進行實驗。

1.2.2 CCK-8 法檢測細胞增殖-毒性 在96 孔板中配置100 μL 的宮頸癌單細胞懸液， 每孔約2500 個細胞，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24 h（37℃，5% CO2），向培養(yǎng)板加入10 μL 不同濃度（0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL）的藥物混合液（實驗組），將96 孔板在培養(yǎng)箱孵育24 h，每孔加10 μL CCK 溶液后，繼續(xù)孵育1 h，避光的條件下，24 h 內測定使用酶標儀測定吸光度（A），CCK-8計算各藥物作用12、24、48 h 和96 h 后對腫瘤細胞增殖抑制率，增殖抑制率（%）=（對照組A 值-實驗組A值）/對照組A 值×100%， 使用CCK-8 篩選最佳金水鮮單藥抑制濃度，進而計算聯(lián)合藥物金水鮮凍與順鉑處理后對宮頸癌細胞的增殖抑制效率。

1.2.3 Western blot 檢測各組蛋白表達情況 蛋白樣品制備，①對照組：向培養(yǎng)液中加入1 mL 0.9%氯化鈉溶液作為對照組。 ②金水鮮組：向培養(yǎng)液中加入0.5 mg/mL 濃度的金水鮮凍干粉注射液1 mL。③順鉑組：根據以往文獻報道，順鉑藥物濃度設定為30 μg/mL，每10 厘米培養(yǎng)液中加入順鉑混懸液1 mL。 ④金水鮮聯(lián)合順鉑組，劑量同②、③，同時加入培養(yǎng)基中處理；于第48 小時收集細胞。 采用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度測定，制備10%分離膠和5%濃縮膠灌注，電泳緩沖液中80 V 電泳，170 mA 恒流轉膜2 h，5%脫脂奶粉中封閉，一抗孵育4℃緩慢搖動過夜。第2 天加入二抗孵育液，室溫濕盒中孵育2 h，之后于生物發(fā)光影像分析儀掃描成像。

1.2.4 PI 染色檢測各組細胞周期變化 4℃條件下，1500 r/min 離心5 min 后收集細胞， 棄上清， 用預冷PBS 洗細胞兩次，預冷的70%乙醇于-20℃固定過夜，次日4℃，1500 r/min 離心5 min 后收集細胞， 繼續(xù)以每管1 mL 的PBS 洗細胞1 次，再加入500 μL PBS 含50 μg/mL 溴化乙錠（PI）細胞染色，100 μg/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4℃避光孵育30 min，上機進行流式分析，一般計數(shù)2 萬～3 萬個細胞，結果用細胞周期擬和軟件Modfit 分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據分析，計量資料數(shù)據用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CCK8 法檢測細胞增殖活力

從圖1 中看出， 宮頸癌細胞使用金水鮮凍干粉0.1、0.2 mg/mL 處理12、24 h 后， 抑制活性均較低，具有時間梯度依賴性的腫瘤細胞增殖抑制效果， 另外，從圖1 中還顯示出金水鮮藥物濃度梯度依賴性對宮頸癌C-33A 增殖活力的影響， 尤其在在處理48 h時，藥物濃度為0.5 mg/mL 的條件下，二者可以協(xié)同發(fā)揮最大效果的抑制細胞增殖效率并達到61.2%，然而繼續(xù)增加濃度， 并不能繼續(xù)提高細胞抑制效率，考慮藥物濃度的飽和作用影響了更高藥物作用的發(fā)揮，與0.1、0.2 mg/mL 金水鮮組比較 （19.8%比37.6%），差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。如圖2 所示，為了證明篩選出的合適的最佳藥物處理濃度具有更好的協(xié)同增效作用， 本研究采用0.5 mg/mL 金水鮮凍干粉聯(lián)合順鉑30 μg/mL 繼續(xù)進行CCK-8 實驗，聯(lián)合藥物在處理48 h 后上機檢測， 金水鮮聯(lián)合順鉑組對細胞的抑制率達82.05%，與單用金水鮮（52.41%）比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01），而與單獨的化療藥物順鉑作用效果（65.24%）比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），提示在一定程度范圍內，金水鮮凍的藥物懸液可以明顯增加順鉑的藥物效力。

圖1 不同濃度金水鮮凍干粉處理宮頸癌C-33A 細胞不同時間點抑制率比較

2.2 各組宮頸癌C-33A 細胞胞p53、p21 等蛋白表達量的比較

金水鮮聯(lián)合順鉑組細胞周期相關蛋白p53、p21在實驗因素處理48 h 后表達明顯上調， 較金水鮮組和對照組效果明顯（P ＜0.05）。 見圖3、表1。

2.3 各實驗處理組的細胞周期變化

圖2 不同藥物處理48 h 后宮頸癌C-33A 細胞增殖抑制率比較

圖3 各組宮頸癌C-33A 細胞p53、p21、GAPDH 表達情況

表1 各組p53、p21、GAPDH 蛋白表達水平比較（）

表1 各組p53、p21、GAPDH 蛋白表達水平比較（）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與金水鮮組比較，#P ＜0.05；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶

組別 p21 p53 GAPDH對照組（n=3）金水鮮組（n=3）順鉑組（n=3）金水鮮聯(lián)合順鉑組（n=3）5679±445 7973±451 13 534±425 27 165±435*#5432±335 6878±395 12 334±362 22 105±373*#11 231±214 11 032±185 11 187±395 10 985±275

金水鮮聯(lián)合順鉑組細胞周期的分布在實驗因素處理48 h 后呈明顯差異，其中細胞在G1期明顯阻滯（55%），較金水鮮組（45%）和對照組（37%）效果明顯（P ＜0.05），考慮金水鮮對腫瘤細胞的抑制可能是通過對細胞周期的阻滯實現(xiàn)的。 見圖4。

3 討論

宮頸癌占的發(fā)病率女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的半數(shù)以上，呈逐年上升趨勢，趨于年輕化[7]，早期的時候主要通過手術治療， 在中晚期的時候主要通過放化療，但疾病的治療效果依然沒有顯著性提高，順鉑是臨床上婦科惡性腫瘤最主要的抗癌藥物[8]，隨著療效的凸顯，劑量限制性毒性主要為腎毒性[2,9]，使用順鉑的患者會出現(xiàn)顯著的尿微量蛋白升高，前期的研究發(fā)現(xiàn)金水鮮可以改善患者的惡性腫瘤癥狀，減輕不良反應，縮短機體免疫恢復造血能力恢復的時間，這些優(yōu)點為臨床聯(lián)合使用順鉑為基礎的化療提供了可能性[10]。

圖4 各組處理48 h 后的細胞周期分布

金水鮮作為天然類藥物，是中國癌癥研究基金會北京鮮藥研制中心與清華大學生命科學與工程研究院共同研制的鮮動植物藥劑，提取鮮蛤蚧、鮮金錢白花蛇、冬蟲夏草、鮮西洋參等藥品中的高效抗癌生物活性物質入藥，近年來的研究及臨床應用表明多靶點地針對DNA 損傷修復， 還可以阻滯腫瘤細胞S 期分裂，從祖國傳統(tǒng)醫(yī)學上講其適用于氣陰兩虛、肺腎不足所致的病癥。傳統(tǒng)臨床用于肺癌患者及化療的合并用藥[11]。 既往已有的基礎實驗研究證明其可能通過增強遲發(fā)超敏反應、調節(jié)T、B 細胞增殖、刺激腫瘤壞死因子分泌等途徑提高機體的免疫功能，從而增強了機體自身的抗腫瘤能力，顯著地抑制腫瘤細胞；其次金水鮮通過對抗化療副作用，產生減毒增效的作用[6,12]。

已有的研究報道在體外動物實驗表明，金水鮮聯(lián)合放療對肺癌等實體瘤的生長有放療協(xié)同作用[12]，本研究中主要通過順鉑聯(lián)合金水鮮藥物懸液在宮頸癌細胞體外實驗的形式，通過繪制腫瘤細胞增殖抑制率曲線，觀察到在不同濃度金水鮮懸液作用下，宮頸癌細胞的倍增活力較對照組明顯減慢，并且隨著劑量的遞增，對細胞生長能力的抑制作用亦呈增強趨勢并存在著劑量效應關系[6,13]。 故從金水鮮的濃度梯度和時間梯度方面證實其單獨抑制癌細胞增殖的有效性，選取了適合體外細胞聯(lián)合治療的濃度和時間，進一步驗證金水鮮聯(lián)合順鉑藥物對宮頸癌細胞的增殖抑制協(xié)同作用以及分析其協(xié)同作用的可能機制，取得了比較好的研究結果。

研究發(fā)現(xiàn)， 不論單用化療藥物還是單用抗癌鮮藥，都較強地抑制了癌細胞的增殖活力，考慮在機制協(xié)同方面有相互的促進作用，隨后本研究通過流式細胞儀的檢測分析和蛋白免疫印跡實驗找到了可能的協(xié)同機制。

一個細胞周期包括有絲分裂期（M）和分裂間期（G1、S、G2），流式細胞儀分析細胞周期各時相中，宮頸癌C-33A 細胞在藥物處理后，S～G2期所占比例較對照組減少，G1時相增加，實驗鏡下觀察過程中本研究通過高倍顯微鏡觀察金水鮮懸液作用下的宮頸癌細胞，核質比例減小，表明單用金水鮮或聯(lián)合順鉑后對腫瘤細胞的DNA 合成早期以及細胞復制所需要的蛋白質成分有明顯的阻斷作用。 通過對宮頸癌C-33A細胞細胞周期的凋亡趨勢分析看到， 與對照組比較，使用化學藥處理的細胞未出現(xiàn)明顯的sub-G1峰，提示細胞的凋亡并不明顯， 但是在DNA 復制晚期S 期的細胞所占比例明顯低于對照組，說明在本實驗藥物作用下， 腫瘤細胞的DNA 合成晚期是藥物主要的作用靶點，從而導致腫瘤細胞的增殖分裂減慢。

眾所周知， 細胞周期進程中有3 個檢查點，即G1～S、S～G2、G2～M 的過渡[14-15]。 在這3 個檢查點上，基因及其蛋白產物調控著細胞周期進程[16]。 p53 蛋白在G1～S 過渡中起關鍵作用[10]。 p2l 蛋白中p53 下游基因的蛋白產物，是周期素依賴性蛋白激酶抑制劑[17]，本實驗證實金水鮮藥物懸液和順鉑藥物聯(lián)合處理，能夠改變實驗細胞株細胞周期的分布形式， 呈現(xiàn)明顯的G1期阻滯， 而于細胞周期相關的蛋白如p21、p53 蛋白等則呈現(xiàn)明顯的積聚?？紤]聯(lián)合藥物處理可能為未來的婦科腫瘤的臨床治療提供一定程度的借鑒[11,18]。

金水鮮通過調節(jié)機體的平衡來提高其抗腫瘤效果，符合現(xiàn)代腫瘤生物治療新模式，是否還存在其他的細胞信號通路仍需要進一步實驗驗證[19]，以及在對宮頸腫瘤細胞侵襲和轉移方面的生物學影響仍然需要研究其和腫瘤表型之間的關系[20-22]，下一步擬開展更詳細的計劃，為臨床合理科學地使用中成藥聯(lián)合現(xiàn)代化療藥物提供理論依據。

綜上所述，本實驗從細胞及分子生物學水平證實了以金水鮮為主要成分聯(lián)合傳統(tǒng)的化療藥物治療宮頸癌細胞惡性表型的可能性，實驗結果確實證實其協(xié)同抑制腫瘤細胞的作用，但仍需在動物模型上進行組織細胞學的驗證和重復。

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