廖志偉 莊雅靖 余宏偉 喻 芳 劉孟忠 周同沖

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，廣東廣州 510095；2.中山大學(xué)腫瘤防治中心放療科，廣東廣州 510060

泛素特異性肽酶22（ubiquitin-specific processing peptidase 22， USP22）屬于去泛素化酶蛋白酶超家族，具有去泛素化的作用。USP22 編碼產(chǎn)物在人類各種正常組織中呈現(xiàn)低豐度表達(dá)，在許多惡性腫瘤細(xì)胞中呈高豐度表達(dá)[1]。由于其在實(shí)體瘤中的特異性分布，可以作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)作為一種干預(yù)基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)工具已廣泛用于抗腫瘤的研究。 慢病毒載體介導(dǎo)的基因表達(dá)或RNAi 作用持續(xù)且穩(wěn)定，其作為新一代高效表達(dá)載體推進(jìn)了腫瘤的基因治療研究。 本研究將CNE-2 細(xì)胞， 轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的CNE-2 穩(wěn)定細(xì)胞株， 轉(zhuǎn)染sh-USP22 質(zhì)粒的CNE-2穩(wěn)定細(xì)胞株，于動(dòng)物背部行皮下注射，觀察其對(duì)裸鼠移植瘤成瘤的影響， 旨在研究USP22 沉默后的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞：正常CNE-2 細(xì)胞，購(gòu)自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室， 培養(yǎng)及保存在廣州永諾生物科技有限公司。本實(shí)驗(yàn)室前期研究以pLL3.7 質(zhì)粒為載體，USP22 shRNA 序列靶點(diǎn)引自本課題組前期實(shí)驗(yàn)靶序列[2-3]，針對(duì)USP22 的編碼序列設(shè)計(jì)的干擾序列如下：

sh-USP22 組：5'-AACTCACGGACAGTCTCAACAATTTCAAGAGAATTGTTGAGACTGTCCGTGTTTTTTC-3'； 3'-TTGAGTGCCTGTCAGAGTTGTTAAAGTTCTCTTAACAACTCTGACAGGCACAAAAAAGAGCT-5'。 陰性對(duì)照組：5'-AACTTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTC-3'； 3'-TTGAAAGAGGCTTGCACAGTGCAAAGTTCTCTTGCACTGTGCAAGCCTCTTAAAAAAGAGCT-5'。

正常CNE-2（陰性對(duì)照），CNE-2 空載體細(xì)胞（Scrambled），USP22 表達(dá)下調(diào)穩(wěn)定細(xì)胞株（sh-USP22），3 種細(xì)胞用含10%胎牛血清（GIBCO）的RPMI 1640 培養(yǎng)液（GIBCO）培養(yǎng)于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的37℃的培養(yǎng)箱中。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6 周齡、雌性、SPF 級(jí)BALB/c 裸鼠9 只，購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 動(dòng)物合格證編號(hào)：No.44008500006768，飼養(yǎng)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 在無特殊病原條件（SPF）下飼養(yǎng)，飼料及水均自由攝入且經(jīng)過嚴(yán)格的滅菌處理。

1.2 裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)方法

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化后，PBS 重懸離心，去除血清，最后將細(xì)胞重懸于PBS 溶液中，調(diào)整密度為5×107個(gè)/mL。 100μL 細(xì)胞懸液，于動(dòng)物右側(cè)背部行皮下注射。

實(shí)驗(yàn)分組：陰性對(duì)照組，CNE-2 空載體細(xì)胞株組（Scrambled 組），USP22 表達(dá)下調(diào)穩(wěn)定細(xì)胞株組 （sh-USP22 組），每組3 只裸鼠。從第2 周開始每周測(cè)量腫瘤體積變化，第8 周結(jié)束實(shí)驗(yàn)，斷頸處死裸鼠，剝?nèi)∧[瘤，稱重，凍存?zhèn)溆谩?根據(jù)公式V=1/2（a×b2）計(jì)算腫瘤體積（V 代表瘤體積，a 為長(zhǎng)徑，b 為短徑）。

1.3 RT-PCR 檢測(cè)USP22 mRNA 的水平

按照Trizol 試劑說明書（Invitrogen 公司）提取腫瘤組織的總RNA，采用Promega 公司的M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)， 用RT-PCR Quick Master Mix（Toyobo 公司）進(jìn)行PCR 反應(yīng)。

以Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，委托英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如下：

USP22-F：5'-CCATTGATCTGATGTACGGAGG-3'；USP22-R：5'-TCCTTGGCGATTATTTCCATGTC-3'；GAPDH-F：5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'；GAPDH-R：5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'。

反應(yīng)體積包括：正反引物各1 μL，cDNA 產(chǎn)物1 μL，Taq 混合物25 μL，去RNA 酶去離子水22 μL，震蕩混勻后放入PCR 儀中，調(diào)整好反應(yīng)程序。 執(zhí)行擴(kuò)增。一般： 在93℃預(yù)變性3～5 min， 進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃40 s→58℃30 s→72℃60 s， 循環(huán)30～35 次，最后在72℃時(shí)保溫7 min。 PCR 產(chǎn)物于4℃保存待電泳檢測(cè)。 PCR 產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂凝膠中，80 V恒壓電泳30 min，在凝膠圖像成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。 記錄結(jié)果并進(jìn)行灰度分析。 選取GAPDH 做內(nèi)參，采用灰度分析計(jì)算USP22 相對(duì)表達(dá)量。

1.4 免疫組化檢測(cè)USP22 蛋白的表達(dá)

分離得到的腫瘤用甲醛固定、組織包埋、石蠟切片、經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、熱抗原修復(fù)。 分別檢測(cè)各組織切片中USP22 的表達(dá)，具體步驟按VECTASTAIN ABC Kit （Vector laboratories 公司）試劑盒的說明書進(jìn)行。 一抗為1∶200 兔抗人USP22 抗體（ab71732，Abcam 公司）， 二抗為羊抗兔IgG 抗體-HRP多聚體。上述各步驟間用PBS 緩沖液洗片3 次、DAB 顯色、蘇木精復(fù)染、光鏡下觀察結(jié)果。將細(xì)胞漿內(nèi)棕黃色顆粒超過腫瘤細(xì)胞漿體積1/4 者計(jì)為陽(yáng)性細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)500 個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)情況及生長(zhǎng)曲線測(cè)定腫瘤的生長(zhǎng)

通過測(cè)量腫瘤長(zhǎng)短徑計(jì)算腫瘤體積，繪制出3 組皮下瘤生長(zhǎng)曲線。 腫瘤生長(zhǎng)曲線顯示，sh-USP22 組腫瘤體積明顯小于陰性對(duì)照組和Scrambled 組， 隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，差異越來越明顯。 見表1。

表1 各組裸鼠腫瘤體積的變化（mm3，）

表1 各組裸鼠腫瘤體積的變化（mm3，）

組別 第3 周 第4 周 第5 周 第6 周 第7 周 第8 周第2 周只數(shù)陰性對(duì)照組Scrambled 組sh-USP22 組333 124.25±11.82 114.05±10.26 104.35±9.39 280.65±19.64 236.25±14.17 168.05±14.28 578.05±63.58 448.05±49.28 245.25±26.97 815.00±73.35 749.65±89.96 321.45±32.14 1208.45±120.85 985.35±86.71 434.85±36.53 1426.05±171.13 1255.45±100.43 501.75±48.67 1651.55±214.70 1448.00±188.24 589.00±64.79

終點(diǎn)時(shí)間第8 周斷頸處死裸鼠后剝離瘤體，sh-USP22 組腫瘤重量（0.54±0.07）g 明顯小于陰性對(duì)照組（1.58±0.24）g 和Scrambled 組（1.46±0.23）g，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05），見圖1。

圖1 鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2 裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線和瘤體比較

2.2 半定量RT-PCR 檢測(cè)USP22 mRNA 水平的變化

獲取腫瘤后，進(jìn)行半定量RT-PCR，以瓊脂糖電泳條帶的亮度來判斷USP22 mRNA 水平高低。 sh-USP22 移植瘤組織出現(xiàn)很弱的特異性條帶，而陰性對(duì)照組和Scrambled 組移植瘤組織條帶明顯較亮。 以GAPDH 為參照基因，分析凝膠成像圖像的灰度值，將獲得的目的基因灰度與參照基因灰度的比值作為表達(dá)量。 結(jié)果分析表明， 以陰性對(duì)照組表達(dá)量為參照（1），sh-USP22 組腫瘤組織中USP22 mRNA 相對(duì)表達(dá)量（0.14±0.09）低于陰性對(duì)照組和Scrambled 組（0.92±0.11），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；而陰性對(duì)照組和Scrambled 組（0.92±0.11）比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

圖2 半定量RT-PCR 檢測(cè)3 組裸鼠移植瘤組織中USP22 mRNA 的表達(dá)

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)移植瘤內(nèi)USP22 蛋白表達(dá)的變化

USP22 蛋白染色陽(yáng)性為深黃色或棕黃色，主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。 免疫組化染色后可見陰性對(duì)照組和Scrambled 組裸鼠皮下移植瘤組織中有較多棕黃色顆粒，細(xì)胞胞質(zhì)中可見明顯棕黃色染色。而sh-USP22 組裸鼠皮下移植瘤中，陽(yáng)性染色細(xì)胞減少，細(xì)胞漿內(nèi)著色顆粒明顯少于陰性對(duì)照組和Scrambled 組， 包漿黃色明顯減弱、變淺，表明注射pLL-shRNA 后人鼻咽癌裸鼠移植瘤中的USP22 蛋白表達(dá)下降。 見圖3（封三）。

圖3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)移植瘤組織中USP22 的表達(dá)情況（200×）

將細(xì)胞漿內(nèi)棕黃色顆粒超過腫瘤細(xì)胞漿體積的1/4 者計(jì)為陽(yáng)性細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)500 個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比。 sh-USP22 組（12.45±1.16）%腫瘤組織中USP22 陽(yáng)性細(xì)胞所占比率明顯低于陰性對(duì)照組（97.25±1.94）%和Scrambled 組（91.28±2.75）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；陰性對(duì)照組（97.25±1.94）%和Scrambled 組 （91.28±2.75）%比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），表明USP22 表達(dá)明顯降低，USP22 shRNA 抑制了USP22 的表達(dá)。見圖4。

3 討論

鼻咽癌是我國(guó)南方常見的惡性腫瘤，放射治療是鼻咽癌最主要的治療方法[4-5]。轉(zhuǎn)移仍是鼻咽癌治療失敗的主要原因[6]。闡明鼻咽癌發(fā)生的分子機(jī)制，從而采取有效的干預(yù)措施控制轉(zhuǎn)移一直是鼻咽癌研究的重點(diǎn)。 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從基因水平調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)成為科學(xué)家們的重點(diǎn)研究方向。

圖4 各組USP22 陽(yáng)性細(xì)胞所占比率

Glinsky 等[7]通過mRNA 微集陣列技術(shù)在多種癌組織中研究證明了一組包含11 個(gè)基因的癌死亡標(biāo)簽，USP22 作為其中一員而引起高度關(guān)注。 人類USP22 基因定位于人17 號(hào)染色體上，由14 個(gè)外顯子組成，其編碼蛋白表達(dá)于細(xì)胞核，具有去泛素化的作用，可以使泛素從復(fù)合物中脫離。 USP22 通過去泛素化修飾達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和促進(jìn)腫瘤增殖的作用，其作為細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的樞紐分子很可能是多種細(xì)胞癌變、浸潤(rùn)的重要環(huán)節(jié)之一[8-11]。

文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)USP22 在多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)普遍升高，并且其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌[12]、宮頸癌[13]、肺癌[14]、甲狀腺癌[15]、腦膠質(zhì)瘤[16]、乳腺癌[17]、食管癌[17]、胃癌[18]、卵巢癌[19]、胰腺癌[20]等惡性腫瘤的預(yù)后有密切的關(guān)系，USP22 表達(dá)增高者預(yù)后差。 USP22 可以通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）促進(jìn)肺癌增殖、侵襲[21]。 本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，USP22 的mRNA 及蛋白水平在多個(gè)鼻咽癌細(xì)胞系（CNE-1，CNE-2）中均較正常鼻咽上皮細(xì)胞（NPEC）明顯升高，為進(jìn)一步肯定這一現(xiàn)象，本研究檢測(cè)了正常鼻黏膜及鼻咽癌組織中USP22 水平，結(jié)果與細(xì)胞系一致，鼻咽癌組織USP22mRNA 及蛋白水平均上調(diào)。 更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，抑制USP22 的表達(dá)使鼻咽癌細(xì)胞株生長(zhǎng)增殖能力降低，USP22 通過使AKT/GSK-3/Cyclin 通路中的p-AKT、p-GSK-3β、cyclinD1 表達(dá)下調(diào)和GSK-3β、AKT 上調(diào)而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)增殖周期[2]。 因此，研究者認(rèn)為USP22 對(duì)鼻咽癌發(fā)生發(fā)展可能有重要影響， 下調(diào)USP22 基因水平能對(duì)腫瘤起治療作用。

RNAi 作為一種簡(jiǎn)單有效的基因敲除方法， 能夠高效、特異沉默目的基因，使突變基因穩(wěn)定沉默而不影響正?；虻谋磉_(dá)，已成為基因功能研究的有力工具。 慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi 作用持續(xù)且穩(wěn)定，能達(dá)到良好的基因治療效果，具有廣闊的應(yīng)用前景。 既往研究已成功構(gòu)建并鑒定USP22 sh-RNA 慢病毒載體，包裝成適合感染目的細(xì)胞的慢病毒顆粒，為進(jìn)一步研究USP22 基因在人鼻咽癌細(xì)胞中的作用機(jī)制打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[3]。

本研究選用BALB/c 裸鼠作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型，具有易成瘤、易飼養(yǎng)、相對(duì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。 通過觀察并記錄各組裸鼠種植瘤的生長(zhǎng)情況， 研究者發(fā)現(xiàn)在USP22 基因表達(dá)沉默后，裸鼠成瘤時(shí)間晚，瘤體生長(zhǎng)明顯減緩。 提示沉默USP22 基因表達(dá)可使人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2 裸鼠移植瘤生長(zhǎng)受到抑制。 RT-PCR和免疫組化的結(jié)果從mRNA 水平和蛋白水平顯示pLL-shRNA-USP22 能明顯抑制腫瘤組織中USP22的表達(dá)， 進(jìn)一步說明USP22 在鼻咽癌的發(fā)展中可能起著重要的促進(jìn)作用。

綜上所述，本研究以pLL3.7 慢病毒質(zhì)粒為載體，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pLL-shRNA-USP22， 通過慢病毒介導(dǎo)的sh-RNA 沉默人鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞中USP22 基因表達(dá)， 可以在裸鼠體內(nèi)抑制腫瘤的生長(zhǎng)。雖然對(duì)人體而言， 鼻咽癌瘤塊內(nèi)直接注射pLLshRNA-USP22 的方法并不可行， 但本研究為臨床利用小RNA 干擾技術(shù)治療鼻咽癌提供了新的治療思路，USP22 基因有望成為鼻咽癌治療的新靶點(diǎn)。

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