枯草芽孢桿菌OKB05菌株不同培養(yǎng)基發(fā)酵上清液的殺線活性

夏彥飛 +鄭偉 蘇盼盼 喬俊卿 王建華 黃曉博

摘要：采用室內(nèi)離體測(cè)定方法，測(cè)試枯草芽孢桿菌OKB05菌株在不同培養(yǎng)基（Landy、LB、λ肉湯、TY、超級(jí)肉湯、胰化蛋白胨肉湯、TYGN、A、M63、M9）的發(fā)酵濾液中對(duì)植物寄生線蟲[南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita） 2齡幼蟲、程氏傘滑刃線蟲（Bursaphelenchus chengi）、豆傘滑刃線蟲（B doui）、擬松材線蟲（B mucronatus）]的生物活性，以期獲得具有較高防效的發(fā)酵培養(yǎng)基。結(jié)果表明：OKB05菌株的培養(yǎng)濾液分別處理植物寄生線蟲6 h后，對(duì)南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲防效較佳的發(fā)酵培養(yǎng)基是TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉湯、超級(jí)肉湯等6個(gè)培養(yǎng)基；對(duì)豆傘滑刃線蟲防效較佳的是TYGN和TY 等2個(gè)培養(yǎng)基；對(duì)豆傘滑刃線蟲、擬松材線蟲防效最佳的是TYGN培養(yǎng)基；OKB05菌株TYGN培養(yǎng)基發(fā)酵上清液對(duì)4種標(biāo)靶線蟲都具有較強(qiáng)的拮抗性。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；植物寄生線蟲；培養(yǎng)基；發(fā)酵濾液；殺線活性；拮抗性

中圖分類號(hào)： S43245文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：002-302（204）2-044-04

物防治研究。Tel：（0379）64282345；E-mail：xyfwcc@63com。

[ZK）]

植物寄生線蟲分布廣，寄主多，是危害農(nóng)作物的主要病原生物之一，每年給主要農(nóng)作物造成的損失高達(dá) 250億美元，同時(shí)它能使真菌和細(xì)菌易侵染植物，也是誘發(fā)植物病害的重要原因之一?；瘜W(xué)防治植物寄生線蟲具有防效好、見效快的特點(diǎn)，但是不可避免地污染了自然環(huán)境，因此生物防治越來越受到廣泛的關(guān)注[2]。利用細(xì)菌生防植物寄生線蟲是當(dāng)今新的研究熱點(diǎn)，各種各樣的細(xì)菌從寄主植物、線蟲體、線蟲的卵、土壤中被分離，其不同的作用方式已被報(bào)道[3-7]。芽孢桿菌（Bacillus spp）能夠產(chǎn)生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機(jī)溶劑的內(nèi)生孢子，是理想的生防菌篩選對(duì)象[8]。關(guān)于芽孢桿菌防治線蟲的研究，國內(nèi)外已有大量的報(bào)道[9-5]。本研究通過室內(nèi)離體試驗(yàn)對(duì)枯草芽孢桿菌（B subtilis）OKB05菌株在不同培養(yǎng)基上的發(fā)酵上清液對(duì)4種植物寄生線蟲[南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）、擬松材線蟲（Bursaphelenchus mucronatus）、豆傘滑刃線蟲（B doui）、程氏傘滑刃線蟲（B chengi）]的防效進(jìn)行評(píng)估。

材料與方法

供試菌種和線蟲

枯草芽孢桿菌OKB05菌株、南方根結(jié)線蟲、擬松材線蟲、豆傘刃線蟲、程氏傘滑刃線蟲，均保存于筆者所在實(shí)驗(yàn)室。

2培養(yǎng)基

本研究中所用的培養(yǎng)基為DA、Landy、LB、λ肉湯、TY、超級(jí)肉湯、胰化蛋白胨肉湯、TYGN、A、M63、M9。DA和Landy的配制分別參考文獻(xiàn)[6-7]，其余培養(yǎng)基的配制參考文獻(xiàn)[8]。

3供試線蟲的培養(yǎng)和分離

擬松材線蟲、豆傘滑刃線蟲、程氏傘滑刃線蟲接種在灰葡萄孢（Botrytis cinerea）上，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)7～ 20 d，轉(zhuǎn)移到4 ℃冰箱備用。南方根結(jié)線蟲的卵塊接種在感病番茄上，放置于溫室中培養(yǎng)50 d左右，然后從番茄根部挑取卵塊，卵塊用3% H2O2表面消毒8 min，再用ddH2O清洗3次后置于4 ℃冰箱中備用。采用貝曼漏斗法分離4種培養(yǎng)好的線蟲。收集好的線蟲先用3% H2O2表面消毒 5 min，然后再用ddH2O清洗3次，此時(shí)得到的線蟲即為試驗(yàn)所用線蟲。

4殺線物質(zhì)的制備

將甘油保存的OKB05菌株在LB平板上劃線，37 ℃過夜活化培養(yǎng)；用滅菌牙簽挑取單菌落于LB液體中培養(yǎng)過夜，37 ℃，200 r/min；第2天按3%的接種量吸取6 mL過夜培養(yǎng)的菌液，分別接種至200 mL 的Landy、LB、TY、超級(jí)肉湯、胰化蛋白胨肉湯、TYGN、A、M63、M9、λ肉湯等0種培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，4 ℃ 0 000 r/min離心5 min，收集上清液。

5室內(nèi)離體試驗(yàn)

吸取發(fā)酵后的培養(yǎng)濾液原液2 mL至直徑為6 cm的滅菌表面皿中，挑入50頭表面消過毒的線蟲，再將該表面皿置于滅過菌的醫(yī)用鋁盒中，放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，以ddH2O、沒有接種細(xì)菌的培養(yǎng)基作對(duì)照，分別在6、2、24、36 h觀察線蟲的死亡情況。在解剖鏡下觀察并記錄線蟲的死亡數(shù)量，線蟲用挑針觸碰，如果不動(dòng)，則認(rèn)定線蟲死亡[9]。

6數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用SSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果與分析

2OKB05菌株在不同培養(yǎng)基上的發(fā)酵上清液對(duì)南方根結(jié)線蟲殺線活性的測(cè)定

表表明，處理后6 h，TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉湯、超級(jí)肉湯、λ肉湯等7個(gè)培養(yǎng)基的發(fā)酵濾液的殺線率與M63、M9、A以及對(duì)照差異顯著；TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉湯、超級(jí)肉湯等6個(gè)培養(yǎng)基發(fā)酵上清液的殺線率都達(dá)到了98%以上，與λ肉湯培養(yǎng)基的殺線率（8392%）差異顯著。隨著處理時(shí)間的延長，2 h后TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉湯、超級(jí)肉湯、λ肉湯等7個(gè)培養(yǎng)基的處理殺線率都達(dá)到了00%，與A、M9、M63及對(duì)照差異顯著。因此，在后續(xù)的研究中僅選擇TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉湯和λ肉湯6種培養(yǎng)基對(duì)OKB05菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，驗(yàn)證其發(fā)酵上清液對(duì)其他植物寄生線蟲的殺線率。[FL）]

[FK（W5][HT6H][Z][WTHZ]表OKB05菌株不同培養(yǎng)基發(fā)酵上清液對(duì)南方根結(jié)線蟲殺線率的影響[WTBZ][HTSS][STBZ]

[H5][BG（！][BHDFG3，WK2，WK48W]培養(yǎng)基[ZB（][BHDWG2，WK48W]殺線率（%）

[BHDWG2，WK2。4W]6 h2 h24 h36 h[ZB）W]

[BHDG2，WK2ZQ2，WK2。4W]TYGN0000±000a0000±000a0000±000a0000±000a

[BHDW]LB0000±000a0000±000a0000±000a0000±000a

[BH]LANDY0000±000a0000±000a0000±000a0000±000a

[BH]TY987±28a0000±000a0000±000a0000±000a

[BH]胰化蛋白胨肉湯9856±50a0000±000a0000±000a0000±000a

[BH]超級(jí)肉湯9857±33a0000±000a0000±000a0000±000a

[BH]λ肉湯8392±054b0000±000a0000±000a0000±000a

[BH]A056±096c26±046b705±33b95±2b

[BH]M9056±096c2±7b467±53c62±33c

[BH]M63000±000c6±086b342±052d60±258c

[BH]ddH2O2（CK）000±000c000±000c000±000f000±000d

[BH]空白（CK2）000±000c000±000c000±000f000±000d[H][BG）F]

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著（<005）。[FK）]

[FL（2K2]22OKB05菌株在6種不同培養(yǎng)基上的發(fā)酵上清液對(duì)擬松材線蟲、豆傘滑刃線蟲、程氏傘滑刃線蟲殺線活性的測(cè)定

表2顯示，用OKB05菌株在6種培養(yǎng)基上的發(fā)酵上清液分別處理程氏傘滑刃線蟲6 h 后，TYGN和TY等 2個(gè)培養(yǎng)基處理防效最佳，殺線率達(dá)00%，與其他4種培養(yǎng)基處理差異顯著；其次是超級(jí)肉湯培養(yǎng)基處理，殺線率為905%，防效較差的是胰化蛋白胨肉湯、LANDY培養(yǎng)基，殺線率分別為658%、5900%，兩者之間差異不顯著。處理2 h后，超級(jí)肉湯、LB等2個(gè)培養(yǎng)基的殺線率也都達(dá)到了00%，TYGN、TY 、超級(jí)肉湯、LB 等4個(gè)培養(yǎng)基差異不顯著，與胰化蛋白胨肉湯、LANDY 培養(yǎng)基差異顯著。至36 h，LANDY培養(yǎng)基與其他5個(gè)培養(yǎng)基之間仍然差異顯著。在所有的處理時(shí)間段，各個(gè)培養(yǎng)基都與對(duì)照差異顯著?？梢娪肙KB05菌株在TYGN和TY 等2個(gè)培養(yǎng)基的發(fā)酵濾液處理程氏傘滑刃線蟲的防效最佳，6 h后線蟲的死亡率就達(dá)到了00%。

用TYGN、LB、TY、LANDY、超級(jí)肉湯、胰化蛋白胨肉湯等6個(gè)培養(yǎng)基的培養(yǎng)濾液分別處理豆傘滑刃線蟲6 h后，線蟲的死亡率分別為8542%、5582%、3857%、3385%、242%、52%，6個(gè)培養(yǎng)基中除了TY和LANDY 等2個(gè)培養(yǎng)基之間差異不顯著外，其余培養(yǎng)基之間差異顯著（表2）。隨著處理時(shí)間的延長，各處理的線蟲死亡率增加，其顯著性差異也出現(xiàn)變化，處理2 h后殺線率最高的是TYGN培養(yǎng)濾液，為9248%，與其余5個(gè)培養(yǎng)基差異顯著；處理24 h后，TYGN、TY、胰化蛋白胨肉湯的培養(yǎng)濾液之間差異不顯著，殺線率分別為00%、00%、9733%，但與其他3個(gè)培養(yǎng)基之間差異顯著；處理36 h后，6個(gè)培養(yǎng)基的殺線率都達(dá)到了92% 以上，其中LANDY、超級(jí)肉湯2個(gè)培養(yǎng)基之間差異不顯著，但與其余4個(gè)培養(yǎng)基之間差異顯著，這4個(gè)培養(yǎng)基之間差異不顯著。在所有的處理時(shí)間段，各個(gè)培養(yǎng)基都與對(duì)照差異顯著。綜合比較結(jié)果表明，對(duì)豆傘滑刃線蟲具有最佳防效的發(fā)酵培養(yǎng)基是TYGN培養(yǎng)基。

表2還顯示，對(duì)擬松材線蟲處理6 h后，防效最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基是TYGN培養(yǎng)基，殺線率為604%，與其他培養(yǎng)濾液之間差異顯著。TYGN培養(yǎng)基的線蟲在處理2、24 h后，線蟲死亡率分別為9575%、00%，在相同的時(shí)間段與其余培養(yǎng)基進(jìn)行比較同樣發(fā)現(xiàn)差異顯著。處理36 h后，LB、超級(jí)肉湯、胰化蛋白胨肉湯、TY等4個(gè)培養(yǎng)濾液的殺線率也達(dá)到了00%，LANDY培養(yǎng)基處理的殺線率為820%，與其他5個(gè)培養(yǎng)基差異顯著。在4個(gè)處理時(shí)間段中除了在6 h，超級(jí)肉湯、胰化蛋白胨肉湯、TY等3個(gè)培養(yǎng)基與對(duì)照差異不顯著之外，其他的各個(gè)培養(yǎng)基都與對(duì)照差異顯著。結(jié)果表明，拮抗擬松材線蟲的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基是TYGN培養(yǎng)基。

南方根結(jié)線蟲和程氏傘滑刃線蟲對(duì)OKB05菌株的發(fā)酵上清液較敏感，處理6 h后殺線率均為00%，豆傘滑刃線蟲為8542%、擬松材線蟲為604%，OKB05菌株在TYGN培養(yǎng)基上的發(fā)酵上清液對(duì)南方根結(jié)線蟲和程氏傘滑刃線蟲殺線率差異不顯著，其余差異顯著；處理后24 h，4種線蟲的死亡率都達(dá)到了00%，且差異不顯著。在不同的處理時(shí)間內(nèi)，OKB05菌株的處理與對(duì)照差異顯著。結(jié)果表明[CM（25]：OKB05菌株TYGN培養(yǎng)基發(fā)酵濾液處理對(duì)4種植物寄[CM）]

3結(jié)論與討論

植物根圍促生細(xì)菌（plant growth-promoting rhizobacteria，GR）不僅可以促進(jìn)植物的生長，還可以防治根結(jié)線蟲病、青枯病、疫病和黃萎病等，成為近幾年興起的新的研究熱點(diǎn)[20-23]。芽孢桿菌屬是GR中極具應(yīng)用潛力的線蟲生防資源，其防治線蟲病的研究也取得了很大的進(jìn)展[24-26]。本研究結(jié)果表明，OKB05菌株在0種不同培養(yǎng)基濾液中都對(duì)南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲有一定的拮抗作用，但是防效有差異，其中TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉湯、超級(jí)肉湯6個(gè)培養(yǎng)基發(fā)酵上清液的處理防效較佳，處理2 h后殺線率達(dá)到了00%，出現(xiàn)該現(xiàn)象可能是因?yàn)樵诓煌呐囵B(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，OKB05菌株產(chǎn)生的殺線蟲活性物質(zhì)成分不同，或者活性物質(zhì)的含量有差異造成的。

TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉湯、超級(jí)肉湯6個(gè)培養(yǎng)基發(fā)酵濾液進(jìn)一步來處理程氏傘滑刃線蟲、豆傘滑刃線蟲、擬松材線蟲 3種植物寄生線蟲，結(jié)果表明，3種植物寄生線蟲對(duì)6種OKB05菌株的培養(yǎng)濾液敏感程度不一致，其中在處理程氏傘滑刃線蟲、豆傘滑刃線蟲、擬松材線蟲6 h后的最佳防效培養(yǎng)基分別是TYGN和TY、TYGN、TYGN，其殺線率分別為00%、8542%、604%，當(dāng)然隨著處理時(shí)間的延長，殺線率也逐漸增加，其處理之間的差異性也會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的變化。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了前面的推測(cè)。OKB05菌株在TYGN培養(yǎng)基上的發(fā)酵上清液對(duì)4種標(biāo)靶線蟲都表現(xiàn)了較佳的防治效果，但拮抗能力有差異，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于不同種的線蟲在抗逆性、敏感性、寄生方式以及蟲體的結(jié)構(gòu)等方面的差異造成的。

本研究為以后生防細(xì)菌的篩選以及如何選擇合適的培養(yǎng)基提供了理論基礎(chǔ)，并為下一步對(duì)枯草芽孢桿菌OKB05菌株生防制劑的開發(fā)和利用以及殺線活性物質(zhì)的分離、鑒定、結(jié)構(gòu)分析奠定了基礎(chǔ)。

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