高效液相色譜法同時測定鳳仙花中的萘醌類和黃酮類成分

姜洪芳　石寶俊　張峰倫　趙伯濤　施國新　張衛(wèi)明

摘要：建立反相高效液相色譜，測定不同花色單瓣鳳仙花和多重瓣茶鳳仙莖、葉、花中指甲花醌、槲皮素、2-甲氧基-1，4萘醌、山奈酚含量。采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，乙腈-25%乙酸水為流動相，梯度洗脫進行分離，檢測波長245 nm。指甲花醌、槲皮素、2-甲氧基-1，4萘醌、山奈酚在選定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為 1013%、9893%、10117%、10159%，RSD分別為0986%、196%、237%、127%，該方法簡單、快速、準(zhǔn)確，可作為鳳仙花中萘醌類和黃酮類物質(zhì)同時測定的方法。

關(guān)鍵詞：鳳仙花；萘醌；黃酮；高效液相色譜法

中圖分類號： O6577+2文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（201412-0344-03[HS][HT9SS]

收稿日期：2014-07-18

基金項目：國家科技支撐計劃（編號：2012BAD36B01 。

作者簡介：姜洪芳（1974—，女，博士研究生，副研究員，從事天然產(chǎn)物活性物質(zhì)應(yīng)用與開發(fā)。E-mail：jhf74@163com。

通信作者：張衛(wèi)明，研究員，從事植物活性物質(zhì)的應(yīng)用與開發(fā)。E-mail：botanyzh@163com。

鳳仙花（Impatiens balsamina L為鳳仙花科（Balsaminaceae鳳仙花屬（Impatiens一年生草本植物。鳳仙花屬共有植物900余種，全球均有分布。鳳仙花作為觀賞植物在國內(nèi)外均有種植，也是該屬植物的常見品種，其花、莖、葉、種子在民間有悠久的藥用歷史，被廣泛用于治療腰脅痛、 蛇咬傷、 鵝掌風(fēng)、 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 癰癤瘡疔、 胎衣不下、 潰瘍?nèi)站貌挥徒?jīng)閉腹痛等，2010年版《中國藥典》收載其種子急性子作為藥用部位。鳳仙花的化學(xué)成分主要有黃酮、萘醌、香豆素、有機酸、花青素和甾醇類，其中黃酮和萘醌有很強的抗炎、抗菌、抗過敏和抑制Wnt信號通道等活性；據(jù)報道指甲花醌和2-甲氧基-1，4萘醌是該植物抗細(xì)菌和抗真菌的活性成分，2-甲氧基-1，4萘醌具有很強的對抗HepG2細(xì)胞的抗腫瘤活性[1-3]。國內(nèi)外已有文獻報道，用高效液相色譜法（HPLC分別定量測定鳳仙花中的黃酮和萘醌類成分[4-7]，但對于2類成分含量的同時測定還未見報道，本研究應(yīng)用HPLC對常見品種單瓣鳳仙花和多重瓣茶鳳仙在7月盛開期的莖、葉、花中指甲花醌、2-甲氧基-1，4萘醌、槲皮素、山萘酚進行了測定，為該屬植物的開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)依據(jù)。

1材料與方法

11材料

高效液相色譜儀Agilent 1200 HPLC（美國安捷倫公司生產(chǎn)，G1354A四元泵，G1313A自動脫氣機，G1316柱溫箱，G1315B二極管陣列檢測器。

Q-600DE型超聲波清洗器，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)；

高效液相色譜（HPLC分析用甲醇、乙腈為色譜純（美國天地；試驗用水為超純水，提取用試劑均為分析純。

對照品包括指甲花醌、2-甲氧基-1，4萘醌、槲皮素、山奈酚，均購于中國食品藥品檢定研究院，純度大于98%。單瓣鳳仙花及多重瓣茶鳳仙的莖、葉、花均于2012年7月采自南京，經(jīng)南京野生植物研究院張玖教授鑒定為鳳仙花（Impatiens balsamina L。

12HPLC分析條件

Agilent Eclipse XDB-C18分離柱（46 mm×150 mm，5 μm；流動相為乙腈-25%醋酸水，梯度洗脫條件：0～10 min，25 ∶[G-3]75；10～20 min，32 ∶[G-3]68；20～35 min，25 ∶[G-3]75，流速10 mL/min，進樣量20 μL，柱溫為25 ℃，DAD檢測器，檢測波長245、250、280、360 nm。

13對照品溶液的制備

分別稱取指甲花醌、2-甲氧基-1，4萘醌、槲皮素、山奈酚對照品10 mg，精確稱定，甲醇溶解并定容，稀釋成濃度為50、40、25、125、10、625、312 μg/mL的溶液，經(jīng)045 μm 微孔濾膜過濾，供HPLC測定，并繪制每種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

14供試品溶液的制備

稱取樣品粉末 （50 ℃ 烘干12 h，磨碎過40目篩 50 g，精確稱定，加入55% 乙醇水溶液80 mL，室溫浸泡2 h，超聲提取 1 h，定容至100 mL，濾液經(jīng)045 μm 的微孔濾膜過濾，供HPLC測定。

2結(jié)果與分析

21標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的HPLC測定

在“12”節(jié)色譜條件下，樣品中指甲花醌、槲皮素、2-甲氧基-1，4萘醌、山奈酚色譜峰的保留時間與對照品一致，4種成分的色譜峰均能得到較好的分離，樣品其他成分對欲測成分的測定無干擾（圖1。

22線性關(guān)系分析

將不同梯度濃度的混合對照品溶液分別進樣，進樣量為20 μL，以峰面積y為縱坐標(biāo)，進樣質(zhì)量濃度x （μg/mL為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

23精密度試驗

準(zhǔn)確吸取25 μg/mL指甲花醌、2-甲氧基-1，4萘醌、槲皮素、山奈酚混合對照品溶液20 μL，按照“23”節(jié)建立的方法進行檢測，重復(fù)測定3次，記錄保留時間和峰面積，計算各個化合物的相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD，均小于 15%（表2，表明儀器精密度良好。

24重復(fù)性試驗

精確稱取紅色鳳仙花葉子粉末5002 3 g，共5份，按照“22”節(jié)方法制備供試品溶液，再按照“23”節(jié)建立的方法進行檢測，重復(fù)測定3次，記錄各化合物峰面積，計算得到各化合物含量的RSD為115 %～237%（表3，表明該方法的重現(xiàn)性良好。

25穩(wěn)定性試驗

供試品溶液于配制后4、10、14、24 h分別進樣，記錄峰面

[F（W21][TPJHF1tif][F][FL]

[F（W9][HT6H][J]表1鳳仙花中不同化合物的線性方程[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W12，W16，W8，W16，W8W]化合物質(zhì)量濃度（μg/mL保留時間（min線性方程相關(guān)系數(shù)

[BHDG12，W12Q3，W16DW，W8DW，W16Q4，W8W]指甲花醌325～520066y=9821x+83960997

[BHDW]槲皮素700～5600105y=4030x-258100997

2-甲氧基-1，4萘醌3625～58000121y=9436x-13340998

山奈酚3625～58000164y=5737x+31050994[HJ][BG）F][F）]

[FL（22]

[F（W8][HT6H][J]表2鳳仙花中不同化合物的保留時間和峰面積精密度[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W9，W20W]化合物[B（][BHDWG12，W10。2W]保留時間峰面積[XXSX2-SX92]均值（minRSD（%[XXSX2-SX92]均值RSD（%[BW]

[BHDG12，W9Q0，W5。4DWW]指甲花醌680452 986087

[BHDW]槲皮素1070621 238123

2-甲氧基-1，4萘醌1230662 784116

山奈酚1650831 610135[HJ][BGF]

注：n=3。[F]

積，結(jié)果峰面積RSD分別為指甲花醌135%、槲皮素236%、2-甲氧基-1、4萘醌253%、山奈酚236%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

26加標(biāo)回收率

[CM（24]精確稱取已知含量的紅色鳳仙花的葉子3份，按照[CM]

[F（W9][HT6H][J]表3紅色鳳仙花葉子中不同化合物的含量[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W11，W9。2W]化合物含量均值（%RSD（%

[BHDG12，W11Q1，W9。2DWW]指甲花醌0204 8115

[BHDW]槲皮素0074 6187

2-甲氧基-1，4萘醌0078 3237

山奈酚0083 2216[HJ][BGF]

注：n=5。[F]

“22”節(jié)方法制備供試品溶液，分別加入50、25 、125 μg/mL指甲花醌、槲皮素、2-甲氧基-1，4萘醌、山奈酚混合對照品溶液，按樣品測定項下方法進行操作，每個濃度每天測定3次，連續(xù)測定3 d，取其平均值，計算回收率（表4。

[FL]

[F（W8][HT6H][J]表4紅色鳳仙花葉子的回收率試驗結(jié)果[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W12，W36，W12W]化合物[B（][BHDWG12，W36W]回收率（%[BHDWG12，W12。3W][XXSX2-SX352]第1天第2天第3天RSD（%

[BHDG12，W12Q1，W12。4W]指甲花醌10021±13510213±12310156±11510130±099

[BHDW]槲皮素9673±1289958±1 5210048±2329893±196

2-甲氧基-1，4萘醌9857±10710173±16110321±09610117±237

山奈酚10026±18510172±218 10279±15610159±127[HJ][BGF]

注：n=3。[F]

[FL（22]27樣品測定

按照“22”節(jié)及“23”節(jié)的方法操作，測定不同鳳仙花樣品的指甲花醌、槲皮素、2-甲氧基-1，4萘醌、山奈酚峰面積，按照“表1”中的標(biāo)準(zhǔn)方程計算出各種化合物的含量，結(jié)果見表5。

[FL]

[F（W10][HT6H][J]表5鳳仙花中萘醌及黃酮化合物含量[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG42，W6，W54W]鳳仙花樣[B（][BHDWG12，W54W]化合物含量（%

[BHDWG12，W132。4W][XXSX2-SX532]指甲花醌2-甲氧基-1，4萘醌槲皮素山奈酚

[BHDWG12，W42。12W][XXSX2-SX13]莖葉花[XXSX2-SX13]莖葉花[XXSX2-SX13]莖葉花[XXSX2-SX13]莖葉花

[BHDG12，W6，W42。12DWW]白色020106900258 006100810836004601750133005303680714

[BHDW]紫色083202140321019400450258003101410131009601770653

紅色011702070236018200800626005500730158007400760603

粉紫色00710342030200040042063200870135002801020362

多重花瓣048400900337008400060135006100670100012801890765[HJ][BG）F][F）]

[FL（22]指甲花醌含量在鳳仙花的葉、花中較高，多數(shù)集中在02%～07% 之間，在紫色鳳仙花的莖中含量最高，為0832%，多重瓣茶鳳仙的莖中含量為0484%；2-甲氧基-1，4萘醌普遍分布在花中，以白色鳳仙花中為最高，達0836%；可見，萘醌類在植株中的總量以白色鳳仙花最高，為2127%，紫色鳳仙花位居第2 ，為1864%，多重瓣茶鳳仙最低，為1136%。槲皮素主要分布在葉和花中，以白色鳳仙花的葉子為最多，達0175%；山奈酚主要分布在各色鳳仙花的葉和花中，多重瓣茶鳳仙含量最高，達0765%，白色鳳仙花中為0714%；以槲皮素和山奈酚為代表的黃酮類物質(zhì)在植株中的總量以白色鳳仙花最高，達1489%，多重瓣茶鳳仙花和紫色鳳仙花分別為1310%、1229%，粉紫色鳳仙花最低，為0714%。

3討論與結(jié)論

31提取溶劑的優(yōu)化

為了使供試品溶液獲得最佳的提取率，參照文獻 [4-7]，應(yīng)用HPLC法比較水、55% 乙醇、95% 乙醇、乙酸乙酯室溫下對紅色鳳仙花葉子浸泡提取的指甲花醌、2-甲氧基-1，4萘醌、槲皮素、山奈酚的含量，以55% 乙醇溶液為溶劑能夠?qū)?種物質(zhì)最大量地提取出來。

32HPLC檢測波長的選擇

由于指甲花醌、2-甲氧基-1，4萘醌、槲皮素、山奈酚的最大吸收波長不完全一致，如指甲花醌、2-甲氧基-1，4萘醌最大吸收波長為250、280、350 nm，其中350 nm處的吸光度比較弱，槲皮素最大吸收波長為255、370 nm，山奈酚最大吸收波長為266、367 nm[5-7]，在HPLC分析中，DAD檢測器設(shè)置了245、250、280、360 nm多通道檢測模式，結(jié)果表明，4個化合物在245 nm處的峰面積均高于其他波長處的峰面積，所以選擇245 nm作為液相色譜分析的檢測波長，從而提高了檢測方法的靈敏度。

33HPLC流動相的確定

通過HPLC分析條件的篩選，有利于在最短的時間內(nèi)將復(fù)雜組份完全分離，特別是有多個樣品需要分析時。用甲醇-水、乙腈-水對鳳仙花的葉子提取物進行分析，結(jié)果顯示乙腈-水分離效果優(yōu)于甲醇-水，縮短了分離時間，將25% 醋酸加入到水中，可以將欲分離的萘醌類物質(zhì)與黃酮類物質(zhì)達到基線分離，同時進行定量測定。

[JP2]從總體來看，白色鳳仙花的萘醌類和黃酮類物質(zhì)含量較高，國外大量研究也是圍繞白色鳳仙花開展的，但紫色、粉紫色及多重瓣茶鳳仙中也含有較高的活性物質(zhì)，可以作為藥用植物進行研究與應(yīng)用。 生長環(huán)境、采收時間、種植資源等因素都會影響植物次生代謝產(chǎn)物的含量，可以利用能增加次生代謝產(chǎn)物的有利因素，進行組織培養(yǎng)，增加次生代謝產(chǎn)物的含量。

本試驗建立了HPLC同時測定鳳仙花中指甲花醌、2-甲氧基-1，4萘醌、槲皮素、山奈酚含量的方法，該方法可同時測定萘醌、黃酮2類成分，可用于鳳仙花藥材的質(zhì)量控制。

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