馥感啉口服液抗腸道病毒71型的藥效學(xué)研究

喬紅偉, 陳威, 高虹

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 北京協(xié)和醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)中心

衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京, 100021)

關(guān)鍵詞:馥感啉口服液; 腸道病毒71型; ICR小鼠; 藥效學(xué)

近年來手足口病(HFMD)的發(fā)病率在中國(guó)呈上升趨勢(shì)，其中重癥和死亡病例腸道病毒71型(EV 71)感染率顯著增高，EV 71的危害性值得警惕和重視[1]。EV 71屬于小RNA病毒科，是引發(fā)手足口病最主要的病原體，通過消化道入侵后在腸壁細(xì)胞中增殖，然后進(jìn)入血液循環(huán)引起全身病毒血癥[2]。普通型手足口病癥狀較輕，主要表現(xiàn)為手掌、腳掌、口腔黏膜等部位的斑丘疹、皰疹，但該病毒可入侵神經(jīng)系統(tǒng)引起嘔吐、眼球震顫、肌陣攣、共濟(jì)失調(diào)、心動(dòng)過速甚至死亡，其危害僅次于脊髓灰質(zhì)炎病毒[3-4]?；純汉筒《緮y帶者均可作為傳染源，因此容易在托幼機(jī)構(gòu)和學(xué)校等幼兒密集場(chǎng)所爆發(fā)，嚴(yán)重威脅全球兒童的身心健康和生命安全[5]。目前，臨床上尚無(wú)有效的抗EV 71病毒藥物或疫苗，因此亟需研制出安全有效且治療機(jī)制明確的藥物。中藥以及中成藥在臨床上表現(xiàn)出較好的抗病毒活性[6]，但抗EV 71的研究主要集中在體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相對(duì)較少[7]。馥感啉口服液由鬼針草、野菊花、西洋參、黃芪、板藍(lán)根、香菇、浙貝母、麻黃、前胡、甘草等組成，具有清熱解毒、止咳平喘、益氣疏表之功效，用于小兒病毒感染療效確切。本實(shí)驗(yàn)旨在評(píng)價(jià)馥感啉口服液在小鼠體內(nèi)對(duì)EV 71的治療效果，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)藥物：馥感啉口服液 (規(guī)格：10 mL/支)，含生藥10 g, 由廣州一品紅制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025275, 生產(chǎn)批號(hào)110703; 0.9%氯化鈉注射液 (規(guī)格: 500 mL), 4.5 g, 由石家莊四藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)121030408。根據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的具體要求，計(jì)算馥感啉口服液的最低有毒劑量為20 g/kg, 由此設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)藥物濃度為高劑量: 20 g/kg; 中劑量: 10 g/kg、低劑量: 5 g/kg，均采用0.9%生理鹽水稀釋。

1.1.2病毒株: C4亞型EV 71病毒小鼠適應(yīng)株，滴度為107TCID50/mL, 由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所保存并提供。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: SPF級(jí)ICR孕鼠12只，各帶乳鼠7只，乳鼠雌雄不限，另外4窩孕鼠備用，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2009-0007。12窩乳鼠分為4組，分別為對(duì)照組、高劑量組、中劑量組和低劑量組各3窩，每窩7只，每組共21只。

1.2　方法

病毒原液用生理鹽水稀釋10倍，在乳鼠10日齡時(shí)，采用腹腔注射方法感染小鼠，每只0.1 mL。2 h后，高、中、低劑量組分別給予20 g/kg、10 g/kg和5 g/kg濃度藥物，給藥體積均為0.2 mL, 對(duì)照組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)給藥6 d。觀察動(dòng)物的外觀(動(dòng)物皮膚毛發(fā)、眼和黏膜的變化)、行為(呼吸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動(dòng)及其他表現(xiàn))、分泌物和排泄物等。給藥后密切觀察動(dòng)物至少2 h，如果出現(xiàn)異常癥狀，詳細(xì)記錄癥狀以及癥狀起始的時(shí)間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時(shí)間等，以后每天至少觀察2次，同時(shí)觀察動(dòng)物存活情況，詳細(xì)記錄死亡數(shù)量。

2結(jié)果

2.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存情況

各組小鼠在感染后第2～3天均出現(xiàn)弓背豎毛等癥狀，感染后第4天出現(xiàn)不同程度的后肢衰弱、單側(cè)或雙側(cè)后肢癱瘓，同時(shí)眼部出現(xiàn)分泌物。高劑量組動(dòng)物出現(xiàn)褐色樣稀便，腹瀉物分布在肛門周圍和被毛。在感染后第4天，對(duì)照組和低劑量組動(dòng)物開始出現(xiàn)死亡，第5天高劑量組和中劑量組動(dòng)物也開始出現(xiàn)死亡，對(duì)照組動(dòng)物死亡高峰集中在第5～11天。在感染第11天后，各給藥組動(dòng)物的腹瀉、眼部分泌物等臨床癥狀有不同程度的緩解和恢復(fù)，個(gè)別后肢癱瘓的動(dòng)物癥狀開始緩解或由雙側(cè)恢復(fù)為單側(cè)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)部分動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)正常。

低、中、高劑量組和對(duì)照組小鼠生存率分別為57.1%(12/21)、52.4%(11/21)、47.6%(10/21)和19.0%(4/21), 經(jīng)Kaplan-Meier曲線分析生存情況顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.369,P=0.039), 進(jìn)一步組間兩兩比較表明，各給藥組生存率均高于對(duì)照組(P<0.05), 而不同劑量組間比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。低、中、高劑量組死亡保護(hù)率分別為47.1%、41.2%、35.3%。

2.2　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量變化

在感染給藥的前5 d內(nèi)動(dòng)物平均體質(zhì)量沒有明顯的變化，在第6天時(shí)高劑量組動(dòng)物體質(zhì)量值略有下降，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各給藥組動(dòng)物在第10天起體質(zhì)量開始緩慢增加，組間比較差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

引發(fā)手足口病的病原體多達(dá)20多種，其中最常見的為柯薩奇病毒A16型(Cox A16)和EV 71。因EV 71感染病程長(zhǎng)、體溫峰值高、容易累及神經(jīng)系統(tǒng)，且預(yù)后比Cox A16更為嚴(yán)重而備受關(guān)注[8-9]。流行病學(xué)顯示，2011年全年確診病例中，EV 71約占50%，且每月確診病例中均以EV 71為主[10]。目前針對(duì)EV 71的基礎(chǔ)研究尚處于初級(jí)階段，由于缺乏合適又經(jīng)濟(jì)的動(dòng)物模型，藥物篩選和評(píng)價(jià)工作的進(jìn)展緩慢。國(guó)外和臺(tái)灣某些研究中使用低于7日齡的乳鼠建立動(dòng)物模型，雖然這類模型對(duì)EV 71較為敏感，但由于其免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未成熟，不能正確模擬人體生理狀態(tài)，在應(yīng)用中受到很大限制[11]。7～10日齡乳鼠是目前作為研究EV 71相對(duì)合適的動(dòng)物模型，既保持了對(duì)病毒的敏感度，又能有效模擬人類致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[12]。本實(shí)驗(yàn)采用10日齡的乳鼠作為評(píng)價(jià)馥感啉口服液抗EV 71藥效的動(dòng)物模型，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均出現(xiàn)典型的病理表現(xiàn)，如體質(zhì)量下降、精神萎靡、豎毛弓背等，說明動(dòng)物模型感染病毒成功。

前期細(xì)胞學(xué)研究證實(shí)馥感啉口服液在體外對(duì)侵染細(xì)胞的EV 71具有抑制作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索馥感啉口服液對(duì)感染EV 71小鼠的藥效和劑量篩查，結(jié)果顯示各劑量藥物對(duì)模型小鼠的治療效果均優(yōu)于對(duì)照組，其中以低劑量組的死亡保護(hù)率較高(47.1%)，而低、中劑量組的療效要優(yōu)于高劑量組。此類問題在多種中藥復(fù)方制劑中都有出現(xiàn)，原因可能是中藥復(fù)方制劑由于成分多樣，配伍的藥物之間相互作用機(jī)制比較復(fù)雜，藥物中的輔藥由于劑量變化而引起作用改變。

馥感啉口服液分別對(duì)接種H1N1和H3N2的細(xì)胞具有直接殺傷和抑制增殖的作用，對(duì)呼吸道合胞病毒也有明顯的體外抑制效果[13]。臨床上亦表明，該制劑治療小兒皰疹性口炎的總體有效率為89.1%、治療病毒性肺炎的有效率為94%，治療效果優(yōu)于其他同類品種[14]。中藥復(fù)方多靶點(diǎn)是其抗病毒作用的重要優(yōu)勢(shì)，除了直接殺傷病毒，馥感啉口服液還可通過提高免疫力增強(qiáng)吞噬功能，改善因病毒感染導(dǎo)致的免疫功能紊亂狀態(tài)。針對(duì)免疫力低下的反復(fù)呼吸道感染患兒，馥感啉口服液的有效率為92.9%，并且可從根本上改善機(jī)體的免疫狀態(tài)，提高小兒預(yù)防流感的能力[15]。有研究證實(shí)，EV 71感染所致的HFMD患兒體內(nèi)存在免疫紊亂，體內(nèi)T細(xì)胞亞群和免疫球蛋白均低于正常同齡兒童，且病情越嚴(yán)重，免疫功能越，雖然尚不能證明這種免疫異常是致病原因還是病毒感染的結(jié)果，但適當(dāng)?shù)拿庖吖δ苷{(diào)節(jié)必須而且有效。

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通信作者:高虹, Email: gaohongdws@aliyun.com

收稿日期:2014-12-15

中圖分類號(hào):R 373.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)05-108-02DOI: 10.7619/jcmp.201505036