王貴波 冷雪秋

(吉林省通榆縣動(dòng)物檢疫站,吉林通榆 137200)

牛病毒性腹瀉的檢疫

王貴波 冷雪秋

(吉林省通榆縣動(dòng)物檢疫站,吉林通榆 137200)

牛病毒性腹瀉是由牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)引起牛的一種接觸性傳染病,也稱黏膜病(MD)。該病以黏膜發(fā)炎、糜爛、壞死和腹瀉為特征。

牛病毒性腹瀉;檢疫;中和試驗(yàn)

1 流行病學(xué)

本病主要是消化道感染，也經(jīng)由呼吸道感染。病毒可以通過胎盤發(fā)生垂直感染。家養(yǎng)和野生的反芻獸及豬是本病的自然宿主，自然感染見于各品種牛，無明顯的種間差異。各種年齡的牛對(duì)本病均易感，尤以6～18個(gè)月齡的育成牛發(fā)病率較多。本病常年發(fā)生，多見于冬季和早春，舍飼和放牧牛都可發(fā)病。封閉式牛群中更易集中爆發(fā)本病。

2 活體檢疫

本病自然感染的潛伏期為7～10d，短者為2d，長者為14d。人工感染的潛伏期多為2～3d。臨床上癥狀輕的為亞臨床感染，嚴(yán)重的為暴發(fā)性致死。急性型：青年牛易發(fā)生急性感染，在臨床上可呈隱性或發(fā)生腹瀉。多表現(xiàn)為突然發(fā)病，體溫升高達(dá)40～42℃，持續(xù)2～3d，有的呈二次升高。精神高度沉郁，厭食，有的病牛常見心率加快，呼吸急促或劇烈干咳。腹瀉常為水樣，一般于發(fā)熱后2～4d，糞有惡臭，含有黏液及血液?？谇火つこ霈F(xiàn)糜爛，之后糜爛融合并壞死。有的病畜康復(fù)快，黏膜損害在10～14d內(nèi)痊愈。慢性型：目前認(rèn)為慢性BVD和MD是持續(xù)感染的繼續(xù)，正常牛不發(fā)生這兩種疾病過程。

3 血清學(xué)診斷

習(xí)慣用細(xì)胞中和試驗(yàn)和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)抗體。雖然在不同毒株之間存在較高程度的交叉反應(yīng)，但在細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒中和試驗(yàn)確實(shí)可以反映不同毒株的某些特征。瓊脂擴(kuò)散則完全是群特異性的，不能鑒別毒株。

3.1 中和試驗(yàn)

（1）材料準(zhǔn)備：①病毒：采用Oregen C24毒株，按常規(guī)方法在犢牛腎、睪丸或鼻甲骨細(xì)胞上繁殖，待75%細(xì)胞出現(xiàn)典型病變收毒，凍融3次，測(cè)定毒價(jià)，分裝于小瓶內(nèi)低溫保存。②細(xì)胞：采用犢牛原代腎細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、鼻甲骨細(xì)胞或MDBK細(xì)胞。③培養(yǎng)液：采用MEM，生長液中加10%犢牛血清，維持液中加2～5%犢牛血清，培養(yǎng)基pH值為7.0～7.2，可加100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素。④被檢血清：無菌靜脈采血，分離血清，并于56℃滅活30min。⑤微量細(xì)胞培養(yǎng)板：進(jìn)口的96孔板可直接使用，國產(chǎn)板須按常規(guī)洗滌、紫外線消毒2～3h后使用。⑥加樣器：單頭或多頭的50～200μl可調(diào)加樣器。

（2）操作程序：①定量試驗(yàn)：首先用多頭加樣器于96孔板每孔中加稀釋液50μl，再取滅能的被檢血清加入微量板的第一排孔中，每份樣品點(diǎn)4個(gè)孔，每孔50μl。用多頭加樣器（調(diào)至50μl）從第一排孔連續(xù)稀釋到最后一排孔，從最后一排孔中棄去50μl。然后用稀釋液將病毒稀釋成含100 TCID50/50μl的工作液，用多頭加樣器于第二排以下各孔中加病毒工作液50μl，第一排孔中加50μl稀釋液作為血清對(duì)照。之后加蓋于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中中和1h，于各孔中加100μl細(xì)胞懸液（將生長良好的單層細(xì)胞用EDTA-胰酶消化液消化分散后用含20%犢牛血清的培養(yǎng)液配制成含40萬/ml的細(xì)胞懸液），置37℃，5%CO2培養(yǎng)6d，從第四天開始觀察結(jié)果，于第六天最終判定。試驗(yàn)均需做病毒回歸、陰性血清、陽性血清和正常細(xì)胞對(duì)照。病毒回歸對(duì)照是以含有100 TCID50/50μl病毒為原液，用稀釋液做3次10倍遞進(jìn)稀釋。取病毒工作液和3個(gè)稀釋度的病毒來做滴定，每個(gè)滴度加4個(gè)孔，每孔再加50μl稀釋液和100μl細(xì)胞懸液。②定性試驗(yàn)：除了將血清做一個(gè)稀釋度即1：5稀釋外，其他步驟同定量試驗(yàn)方法。

（3）結(jié)果判定：試驗(yàn)后第四天開始觀察判定，并于第六天終判，對(duì)照細(xì)胞孔內(nèi)細(xì)胞單層良好，病毒用量為100 TCID50/50μl（50～500 TCID50/50μl范圍內(nèi)均可認(rèn)為試驗(yàn)成立），陽性血清對(duì)照孔不出現(xiàn)細(xì)胞病變，陰性細(xì)胞孔出現(xiàn)細(xì)胞病變方可進(jìn)行結(jié)果判定。

判定標(biāo)準(zhǔn)：定量試驗(yàn)中，根據(jù)所得結(jié)果按Karber計(jì)算50%保護(hù)量（PD50）即為該血清的中和效價(jià)。其中PD50=L＋d（S-0.5），L為病毒最低稀釋度的對(duì)數(shù)，d為稀釋系數(shù)，S為死亡（感染）比值的和。定性試驗(yàn)中，每份被檢血清在1：5稀釋度時(shí)有2個(gè)或2個(gè)以上孔的細(xì)胞完全被保護(hù)，該血清即為陽性。

3.2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)只能粗略測(cè)定被檢血清中的抗體，其敏感性不如血清中和試驗(yàn)。

（1）材料準(zhǔn)備：標(biāo)準(zhǔn)抗原通常用大瓶培養(yǎng)的犢牛睪丸或腎單層細(xì)胞制備，當(dāng)細(xì)胞長成單層時(shí)，按每個(gè)細(xì)胞感染1個(gè)TCID50的Oregon C24毒株的復(fù)侵率進(jìn)行接毒，之后于35℃培養(yǎng)4d，倒去維持液，加入標(biāo)準(zhǔn)的胰蛋白酶-EDTA細(xì)胞分散劑使細(xì)胞分散。離心沉淀，取沉淀病毒細(xì)胞，再用少量鹽水（約原培養(yǎng)液的1%）將細(xì)胞作成病毒懸液，冰凍保存?zhèn)溆?。臨時(shí)用時(shí)，作成一定的稀釋度后與標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行反應(yīng)，檢驗(yàn)其特異性，并標(biāo)定其在本試驗(yàn)中的最合適的確實(shí)效價(jià)。標(biāo)準(zhǔn)血清通常由實(shí)驗(yàn)感染的康復(fù)豬采取，選取其中含有高價(jià)抗體者應(yīng)用。這種血清經(jīng)嚴(yán)格的特異性檢查，并于不同稀釋度下與標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行反應(yīng)，確定本試驗(yàn)合適的稀釋度。瓊脂板用pH7.4 0.01M PBS制備1%的瓊脂板。

（2）操作程序：先在平皿內(nèi)瓊脂板上打孔，孔徑6mm，孔間距2mm，將周圍孔中最靠近平邊緣的一孔標(biāo)記為1，并按順時(shí)針方向?qū)⑵渌骺讟?biāo)記成2～6。標(biāo)準(zhǔn)抗原滴入中央孔，標(biāo)準(zhǔn)血清滴入1、3、5孔，將被檢血清分別滴入2、4、6孔。加完樣后將瓊脂板置濕盒內(nèi)于室溫下感作24h判定。陰性反應(yīng)及可疑反應(yīng)孔應(yīng)延長至28h，再作一次終判。

（3）結(jié)果判定：在正常情況下，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清與標(biāo)準(zhǔn)抗原之間出現(xiàn)明顯的沉淀線，而標(biāo)準(zhǔn)陰性血清與標(biāo)準(zhǔn)抗原間不出現(xiàn)沉淀線。被檢血清與標(biāo)準(zhǔn)抗原間出現(xiàn)沉淀線時(shí)結(jié)果為陽性。而被檢血清與標(biāo)準(zhǔn)抗原間不出現(xiàn)沉淀線時(shí)結(jié)果為陰性。

[1] 牛國輝，季新成，段曉東，等.牛病毒性腹瀉病毒的分離與鑒定[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（47）：986-991.