田小冰，程焱，宋毅軍

(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300052)

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顳葉癲癇大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬中l(wèi)et-7e和miR-23的表達變化

田小冰，程焱，宋毅軍

(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300052)

摘要：目的觀察顳葉癲癇大鼠海馬中l(wèi)et-7e和miR-23在癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)后不同時間點的表達變化。方法160只大鼠，隨機分為生理鹽水對照組10只、癲癇模型組150只，癲癇模型組制備氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的顳葉癲癇大鼠模型，并將SE后不同時間點(0 h、1 h、6 h、12 h、1天、2天、7天、10天、30天、50天)分為10個組，每組15只。采用熒光實時定量PCR檢測各組大鼠海馬let-7e和miR-23。結(jié)果癲癇模型組SE后0 h、1 h、6 h、12 h、1天、2天、7天、10天、30天、50天let-7e相對表達量分別為0.61、0.84、0.85、1.40、10.74、0.71、0.65、1.52、1.69、0.13，miR-23相對表達量分別為0.27、0.31、0.41、0.39、4.49、0.21、0.18、0.12、0.83、2.40，與生理鹽水對照組比較，P均<0.05。結(jié)論 顳葉癲癇大鼠SE后海馬中l(wèi)et-7e和miR-23均先出現(xiàn)表達水平上調(diào)，24 h達到峰值后表達水平下調(diào)，let-7e在10～30天表達水平再次升高，miR-23在30～50天表達水平再次升高。

關(guān)鍵詞：顳葉癲癇；癲癇持續(xù)狀態(tài)；let-7e基因；miR-23基因；動物實驗?zāi)Ｐ停缓ｑR

顳葉癲癇(TLE)是臨床常見的癲癇類型，但其發(fā)病機制目前尚不完全清楚[1,2]。microRNA(miRNA)是一種長度為22個核苷酸左右的非編碼蛋白的內(nèi)源性RNA，在細胞中與靶基因特定序列相互作用，實現(xiàn)其生物學(xué)作用[3]。近年來，miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用一直是神經(jīng)病學(xué)的研究熱點[4]。研究[5]證實，let-7e廣泛表達于海馬中，并在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生、分化過程中起重要調(diào)節(jié)作用。miR-23在神經(jīng)分化過程中僅存在于星形膠質(zhì)細胞[6]，并參與調(diào)控細胞生長和細胞凋亡[7]，對腦神經(jīng)髓鞘的形成及形態(tài)維持也有重要的調(diào)節(jié)作用[8]。我們的前期研究[9]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比，顳葉癲癇大鼠海馬組織中差異表達的miRNA有23個，let-7e差異性表達下調(diào)，miR-23a/b差異性表達上調(diào)。本研究進一步觀察了顳葉癲癇大鼠海馬中l(wèi)et-7e和miR-23在癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)后不同時間點的動態(tài)表達變化規(guī)律，為探明它們在顳葉癲癇中的作用打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1動物和試劑實驗用二級SD大鼠160只，雄性，鼠齡3～4個月，體質(zhì)量(300±20)g，由北京維通利華動物中心提供。實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，觀察無自發(fā)性癲癇發(fā)作入選。所有大鼠隨意飲水、進食，保持12 h白晝及12 h黑夜的周期環(huán)境。動物飼料由Beijing HTK公司提供。匹羅卡品購自永光制藥有限公司(批號：H20013263)，地西泮和硫酸阿托品購自天津金耀氨基酸有限公司。TRIzol Reagent和DEPC treated water購自美國Invitrogen公司。無水乙醇、氯仿、異丙醇購自天津生化廠。RNA-free Eppendorf管及TIPs購自北京索來寶科技公司。Let-7e、miR-23和U6 Hairpin-itTMmiRNAs Quantitaion Kit購自上海GenePharma公司。Agarose購自Biowest公司。

1.2顳葉癲癇大鼠模型的制備及分組將160只大鼠隨機分為生理鹽水對照組10只、癲癇模型組150只。顳葉癲癇模型的制備方法和認(rèn)定方法詳見文獻[2]。其中癲癇模型組大鼠根據(jù)SE后不同時間點(0 h、1 h、6 h、12 h、1天、2天、7天、10天、30天、50天)分為10個組，每組15只。

1.3海馬組織let-7e、miR-23檢測方法將各組大鼠斷頭處死后根據(jù)Pellegrino大鼠腦立體定位圖譜，在60 s內(nèi)將海馬組織從大腦中剝離出來，迅速置入凍存管投入液氮中保存。參照TRIzol Reagent說明書提取海馬組織總RNA，用Nanodrop分光光度計測量濃度，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物質(zhì)量。按照Hairpin-itTMmiRNAs Quantitaion Kit說明書分別對let-7e、miR-23和U6進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL，RNA上樣量為200 ng，反應(yīng)條件為16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，85 ℃、10 min。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20 ℃保存。按照Hairpin-itTMmiRNAs Quantitaion Kit說明書對miRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR擴增，儀器為DNA Engine Opticon 2 PCR，反應(yīng)條件為95 ℃、3 min預(yù)變性，95 ℃、12 s變性，62 ℃、40 s退火延伸，62 ℃讀板，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物質(zhì)量。其中，let-7e引物序列的F-Primer為CATTCTCTCAGATG-AGGTAGGAGG；R-Primer為TATGGTTGTTCTGCTC-TCTGTGTC。miR-23引物序列的F-Primer為TCACACTATATCACATTGCCAGG；R-Primer為TATGGTTGT TCTGCTCTCTGTCTC。Homo U6 snRNA引物序列的F-Primer為ATTGGAACGATACAGAGAAGATT；R-Primer為GGAACGCTTCACGAATTTG。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。由Opticon Monitor 2軟件獲得PCR擴增產(chǎn)物原始CT值。實驗數(shù)據(jù)參照Schmittge等[10]發(fā)表于Nature protocols上的方法，以mean 2-ΔCT±S.D.(C.V.)表示各組結(jié)果，其中2-ΔCT=2-Δ(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)。各時間組基因相對表達量(RQ)=2-ΔCT處理組/2-ΔCT正常組。組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

海馬總RNA擴增條帶清晰，無雜帶及拖尾現(xiàn)象，各基因擴增條帶均一，片段長度均在50～100 bp。各組取7只大鼠，以Homo U6 snRNA標(biāo)準(zhǔn)化，生理鹽水對照組、癲癇模型組0 h、1 h、6 h、12 h、1天、2天、7天、10天、30天、50天let-7e相對表達量分別為0.016 80±0.002 60(15.3%)、0.010 19±0.001 10(10.7%)、0.014 07±0.000 80(5.3%)、0.014 30±0.001 10(7.9%)、0.023 56±0.004 80(20.5%)、0.180 38±0.026 90(14.9%)、0.011 99±0.001 20(9.7%)、0.010 91±0.002 00(18.4%)、0.025 57±0.004 20(16.5%)、0.028 42±0.003 20(11.4%)、0.002 22±0.000 30(13.4%)；癲癇模型組各時間點RQ分別為0.61、0.84、0.85、1.40、10.74、0.71、0.65、1.52、1.69、0.13，與生理鹽水對照組比較，P<0.05或<0.01。各組取7只大鼠，以Homo U6 snRNA標(biāo)準(zhǔn)化，生理鹽水對照組、癲癇模型組0 h、1 h、6 h、12 h、1天、2天、7天、10天、30天、50天miR-23相對表達量分別為0.052 64±0.008 00(15.2%)、0.014 19±0.002 80(19.5%)、0.016 35±0.000 90(5.6%)、0.021 39±0.001 80(8.5%)、0.020 64±0.004 20(20.3%)、0.023 63±0.030 80(13.0%)、0.010 87±0.002 10(19.8%)、0.009 49±0.001 70(18.3%)、0.006 21±0.000 80(14.1%)、0.043 63±0.001 50(3.3%)、0.126 40±0.022 20(17.5%)；癲癇模型組各時間點RQ分別為0.27、0.31、0.41、0.39、4.49、0.21、0.18、0.12、0.83、2.40，與生理鹽水對照組比較，P<0.05或<0.01。

3討論

近年來，研究miRNA在顳葉癲癇中的作用已成為癲癇研究領(lǐng)域的熱點之一。我們對慢性期顳葉癲癇大鼠海馬通過miRNA微陣列技術(shù)進行分析發(fā)現(xiàn)，有包括let-7e和miR-23a/b在內(nèi)的多種miRNA表達異常。這一前期研究僅篩查了慢性期顳葉癲癇大鼠海馬中差異性表達的miRNA，并不了解這些差異性表達的miRNA在SE至慢性顳葉癲癇形成過程中的動態(tài)變化規(guī)律。

本研究結(jié)果顯示，匹羅卡品所致顳葉癲癇的急性期(SE后1周內(nèi))，let-7e和miR-23均先出現(xiàn)表達水平上調(diào)，24 h達到峰值后表達水平下調(diào)，在SE后24 h，let-7e和miR-23的表達水平分別達到了正常大鼠的10.7倍和4.49倍，至1周時，let-7e和miR-23的表達水平甚至低于正常大鼠(下調(diào)表達，RQ<1)。在慢性期(SE后2周至2月)，let-7e在SE后10天和30天表達水平明顯上調(diào)，在50 d時又下調(diào)表達至非常低的水平(RQ=0.13)；miR-23在SE后7～10 d表達水平明顯下調(diào)，在SE后30～50天時表達明顯上調(diào)，至SE后50天其表達水平為正常大鼠的2.4倍。這一研究結(jié)果在國內(nèi)外首次表明了let-7e和miR-23在癲癇大鼠SE后海馬內(nèi)不同時間點的表達變化規(guī)律，為進一步探討它們在顳葉癲癇發(fā)生過程中的作用打下了基礎(chǔ)。

目前研究認(rèn)為突觸重塑和苔蘚纖維發(fā)芽在顳葉癲癇的形成過程中發(fā)揮重要作用。在匹羅卡品誘導(dǎo)的顳葉癲癇大鼠模型中，SE后24 h是突觸重塑發(fā)生的早期階段[11]，而此時期let-7e和miR-23表達量達到峰值。我們推測，這兩種miRNA可能參與調(diào)控突觸重塑的過程，與苔蘚纖維發(fā)芽密切相關(guān)。miR-23在神經(jīng)分化過程中僅存在于星形膠質(zhì)細胞，其在細胞缺氧環(huán)境中表達明顯下調(diào)[12]，并參與調(diào)控細胞生長與凋亡，我們推測其通過參與調(diào)控星形膠質(zhì)細胞的增生，參與顳葉癲癇的發(fā)生過程。let-7e和miR-23在SE后大鼠海馬中的表達變化，尤其是SE后24 h表達明顯上調(diào)，推測它們可能通過某種作用機制參與顳葉癲癇的發(fā)生過程。

探明let-7e和miR-23調(diào)控的靶基因?qū)M一步研究let-7e和miR-23在顳葉癲癇中的作用非常必要。let-7e通過調(diào)控Ras和HMGA2等基因的表達，在腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用[13,14]，通過調(diào)控miRNP相關(guān)蛋白FMRP在胚胎干細胞的神經(jīng)分化中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[15]，并可通過調(diào)控TLR4在致炎機制中發(fā)揮作用[16]。miR-23b參與調(diào)控hes1 mRNA轉(zhuǎn)錄后表達參與神經(jīng)分化過程，miR-23負調(diào)控PGC-1a基因影響骨骼肌活性[17]。本研究結(jié)果闡明了SE后顳葉癲癇海馬中不同時間點let-7e和miR-23的表達水平變化規(guī)律，let-7e和miR-23是否也通過調(diào)控這些基因參與到顳葉癲癇的致病過程，還有待進一步深入研究來證實。

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Expression changes of let-7e and miR-23 in hippocampus of rats with

temporal lobe epilepsy after status epilepticus

TIANXiao-bing,CHENGYan,SONGYi-jun

(GeneralHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300052,China)

Abstract:Objective To detect the expression changes of let-7e and miR-23 in the hippocampus of rats with temporal lobe epilepsy (TLE) at different time points after status epilepticus (SE). MethodsA total of 160 rats were randomly divided into the control group (n=10) which was injected with normal saline, and the TLE group (n=150) which was induced by lithium-pilocarpine. TLE group was divided into 10 subgroups by different time points (0 hour, 1 hour, 6 hours, 12 hours, 1 day, 2 days, 7 days, 14 days, 30 days and 50 days) after SE and each subgroup was consist of 15 rats. The real-time fluorescent quantitative PCR was performed to detect the expression changes of let-7e and miR-23 in all rats. ResultsThe relative expression levels of let-7e in the TLE subgroups were 0.61, 0.84, 0.85, 1.40, 10.74, 0.71, 0.65, 1.52, 1.69 and 0.13at the time points of 0 h, 1 h, 6 h, 12 h, 1 d, 2 d, 7 d, 14 d, 30 d and 50 d. When we compared with that of the normal saline group, significant differences were found (all P<0.05). The relative expression levels of miR-23 in the TLE subgroups were 0.27, 0.31, 0.41, 0.39, 4.49, 0.21, 0.18, 0.12, 0.83 and 2.4 at the time points of 0 h, 1 h, 6 h, 12 h, 1 d, 2 d, 7 d, 14 d, 30 d and 50 d. When we compared with that of the normal saline group, significant differences were found (all P<0.05).ConclusionsThe expression of let-7e and miR-23 in the hippocampus of TLE rats was first up-regulated to the peak value at 24 h after SE and then it began to down-regulate. A second up-regulated expression was seen from 10 d to 30 d after SE with let-7e and from 30 d to 50 d with miR-23.

Key words:temporal lobe epilepsy; status epilepticus; let-7e; mir-23 gene; experimental animal model; hippocampus

收稿日期：(2015-06-25)

通信作者簡介：宋毅軍(1972-)，男，主任醫(yī)師，教授，研究方向為腦血管病、癲癇的診斷與治療。E-mail: songyijun2000@gmail.com

作者簡介：第一田小冰(1985-)，男，主治醫(yī)師，研究方向為腦血管病、癲癇的診斷與治療。E-mail:xbtian@tmu.edu.cn

基金項目：天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計劃(10JCYBJC13800)。

中圖分類號：R742.1

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)47-0007-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.003