西安交通大學(xué)附屬西安市中心醫(yī)院血研所(西安 710003)

郭曉波 藺 京 楊 樂(lè) 胡志萍△ 姚 靜▲ 鄭全慶*

急性早幼粒細(xì)胞白血病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞PML-RARα融合基因檢測(cè)和意義

西安交通大學(xué)附屬西安市中心醫(yī)院血研所(西安 710003)

郭曉波 藺 京 楊 樂(lè) 胡志萍△姚 靜▲鄭全慶*

目的：探討PML-RARα融合基因與急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)的相關(guān)性。方法： 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)50例APL患者血液標(biāo)本(骨髓/外周血)中PML-RARα融合基因含量，30例健康體檢者作為正常對(duì)照組。結(jié)果： 50例APL患者血液標(biāo)本中PML-RARα融合基因含量陽(yáng)性47例(94%；47/50)，陰性3例(6%；3/50)。正常對(duì)照組均陰性，APL組陽(yáng)性率明顯高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。30例治療后血液學(xué)完全緩解的患者治療前后進(jìn)行PML-RARα融合基因的檢測(cè)，其中25例患者(25/30；83.3%)的PML-RARα融合基因拷貝數(shù)較治療前有明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另16.7%(5/30)患者復(fù)發(fā)時(shí)PML-RARα融合基因拷貝數(shù)明顯增高，與初診時(shí)無(wú)明顯差異。結(jié)論： 檢測(cè)PML-RARα融合基因?qū)PL患者在診斷、療效觀察和預(yù)后判斷等方面都具有重要意義。

急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acute promyelocytic leukemia, APL)為急性髓細(xì)胞白血病(Acute myelocytic leukemia, AML)的一種亞型，約占AML的7%～27%[1]?；颊吖撬柚谐霈F(xiàn)大量異常早幼粒細(xì)胞，其中95%以上伴有特異性染色體異位t(15;17)(q22;q21)/ PML-RARα融合基因陽(yáng)性[2]。APL患者的臨床特點(diǎn)是出血傾向嚴(yán)重，常易并發(fā)彌散性血管內(nèi)凝血(Diffuse intravascular clotting ,DIC)，導(dǎo)致早期死亡。但隨著全反式維甲酸(All-trans-retinoicacid, ATRA)、砷劑及聯(lián)合化療的廣泛應(yīng)用，APL患者的臨床緩解率及5年生存率居急性髓細(xì)胞白血病首位[3]。如何更好的對(duì)APL患者進(jìn)行早期診斷，療效觀察及預(yù)后判斷成為影響患者獲益的重要因素。PML-RARα作為一種轉(zhuǎn)錄抑制物通過(guò)抑制多種骨髓分化相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生效應(yīng)[4]。同時(shí)PML-RARα也有針對(duì)AP-1、GATA2等轉(zhuǎn)錄因子共激活物的功能。有研究顯示部分白血病含有染色體交互異位，產(chǎn)生的融合基因與白血病的發(fā)生，發(fā)展密切相關(guān)。本文對(duì)APL患者進(jìn)行PML-RARα融合基因檢測(cè)，分析其與APL的相關(guān)性。

資料和方法

1 一般資料 50例APL病例均為我院2012年8月～2014年6月住院病人，均經(jīng)骨髓涂片和活檢診斷證實(shí)，其中男28例,女22例，年齡14～60歲，中位年齡44歲。正常對(duì)照組30例,男18例，女12例,均為我院健康體檢者，年齡20～65歲,中位年齡39歲,均排除肝、腎，心腦血管疾病和血液學(xué)的異常。所有臨床資料及標(biāo)本均在取得患者知情同意后采集。根據(jù)1987年全國(guó)白血病化療討論會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)，APL患者給予全反式維甲酸(ATRA)、砷劑及DA方案治療。

2 儀器與試劑 美國(guó)伯樂(lè)CFX96熒光定量PCR儀，RNAprep pure血液總RNA提取試劑盒天根生化科技有限公司，融合基因試劑盒(PML-RARα)購(gòu)自上海之江生物科技股份有限公司。

3 檢測(cè)方法 抽取患者骨髓或者靜脈血5.0ml加入裝有EDTAK2作為抗凝劑的試管中，混勻，將標(biāo)本通過(guò)使用紅細(xì)胞裂解液除去血液(骨髓)中的紅細(xì)胞，獲得白細(xì)胞；用RNAprep pure血液總RNA提取試劑盒從上步獲得的白細(xì)胞沉淀中提取RNA。將核酸熒光PCR混合液分別與等人份的RT-PCR酶混合，震蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心5sec。將上述配制好的體系置于PCR管中，然后將提取好的RNA、DEPC-H2O、對(duì)照品、標(biāo)準(zhǔn)品分別加入對(duì)應(yīng)管內(nèi)。反應(yīng)管置于熒光PCR儀上，設(shè)置循環(huán)參數(shù)：45℃×20min→95℃×5min，再按95℃×15sec→58℃×30sec→72℃×45sec,循環(huán)45次；單點(diǎn)熒光檢測(cè)在58℃。利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照操作規(guī)范進(jìn)行，同時(shí)做內(nèi)參，陽(yáng)性和陰性對(duì)照，均在控。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

50例APL患者PML-RARα融合基因陽(yáng)性47例，占94%(47/50)，陰性3例，占6%(3/50)。正常對(duì)照組均為陰性。APL初診組陽(yáng)性率明顯高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中42例經(jīng)全反式維甲酸(ATRA)、砷劑、DA方案化療治療后血液學(xué)完全緩解(CR)。30例血液學(xué)完全緩解患者治療前后進(jìn)行PML-RARα融合基因的檢測(cè)，其中25例(83.3%)PML-RARα融合基因拷貝數(shù)明顯下降，平均下降倆個(gè)數(shù)量級(jí)，治療前后比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。觀察其中5例患者復(fù)發(fā)時(shí)PML-RARα融合基因拷貝數(shù)明顯增高，與初診時(shí)拷貝數(shù)無(wú)明顯差異(P>0.05)。

討 論

急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)是一種以早幼粒細(xì)胞分化受阻為主要特征的急性髓系白血病，此病起源于髓系早幼粒細(xì)胞，由于其腫瘤細(xì)胞中存在較多的促凝顆粒， 臨床上多伴發(fā)彌散性微血管凝血， 易導(dǎo)致 APL 患者的早期死亡[5]。尋找能夠有效對(duì)APL患者進(jìn)行早期診斷，療效觀察及預(yù)后判斷而且臨床應(yīng)用簡(jiǎn)單快捷的檢驗(yàn)指標(biāo)對(duì)臨床診療具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)95%以上的APL伴有特異性染色體異位t(15;17)(q22;q21)/ PML-RARα融合基因陽(yáng)性[2]。本研究中通過(guò)RT-PCR對(duì)50例APL患者進(jìn)行PML-RARα融合基因檢測(cè)，陽(yáng)性率達(dá)94%，敏感度高。我們進(jìn)一步對(duì)經(jīng)治療后血液學(xué)完全緩解的患者進(jìn)行治療前后的對(duì)比，結(jié)果顯示絕大多數(shù)患者PML-RARα融合基因拷貝數(shù)出現(xiàn)明顯下降，進(jìn)一步觀察，出現(xiàn)復(fù)發(fā)后PML-RARα融合基因拷貝數(shù)再次增高，說(shuō)明該基因拷貝數(shù)與治療療效明確相關(guān)?？梢灶A(yù)測(cè)APL患者的治療反應(yīng)，定量白血病細(xì)胞的殘余數(shù)量和預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)。有研究顯示該指標(biāo)比細(xì)胞遺傳學(xué)檢查早數(shù)月。PML-RARa 陽(yáng)性強(qiáng)烈預(yù)示著復(fù)發(fā)的可能，而其持續(xù)陰性則預(yù)示病人有更長(zhǎng)的無(wú)病生存期。

本研究提示對(duì)APL患者進(jìn)行PML-RARα融合基因檢測(cè)有重要的臨床價(jià)值，可為患者的診斷，療效觀察和預(yù)后判斷提供有效的幫助。臨床全面復(fù)發(fā)時(shí)拷貝數(shù)水平相當(dāng)或超過(guò)初診時(shí)，提示選擇的分子標(biāo)志在疾病復(fù)發(fā)時(shí)仍能檢測(cè)到，進(jìn)一步證實(shí)了檢測(cè)結(jié)果的可靠性，并為臨床更加準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)早期復(fù)發(fā)提供依據(jù)。

[1] Mi J. Current treatment strategy of acute promyelocytic leukemia. FrontMed[J],2011,5(4) :341-347.

[2] de Thé H,Le Bras M, Lallemand-Breitenbach V. The cell biology of disease:Acute promyelocytic leukemia, arsenic, and PML bodies[J]. J Cell Biol, 2012,198(1): 11-21.

[3] Sanz MA. Lo-Coco F, Modern approaches to treating acute promyelocytic leukemia[J]. J Clin Oncol,2011,29(5): 495-503.

[4] Ablain J, de The H .Revisiting the differentiation paradigm in acute promyelocytic leukemia[J]. Blood 2011,117: 5795 - 5802.

[5] Matsushita T,Watanabe J, Honda G,etalThrombomodulin alfa treatment in patients with acute promyelocytic leukemia and disseminated intravascular coagulation: A retrospective analysis of an open-label, multicenter, post-marketing surveillance study cohort [J]. Thromb Res ,2014,33(5):772-781.

(收稿：2015-01-20)

白血病，早幼粒細(xì)胞，急性/免疫學(xué) 單核細(xì)胞 @PML-RARα基因 基因融合

R392.7

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.011

△西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院

▲西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院

*通訊作者：西安交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院