孔德謙 王俊勤 蔡國棟

(1.泰山醫(yī)學院，山東泰安271016;2.泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨科，山東泰安271000)

脊柱后縱韌帶骨化發(fā)病機制的分子生物學研究進展

孔德謙1王俊勤2蔡國棟2

(1.泰山醫(yī)學院，山東泰安271016;2.泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨科，山東泰安271000)

韌帶骨化病;脊柱;研究進展

韌帶骨化病是一種好發(fā)于老年群體中的疾病，其好發(fā)年齡為50～60歲的個體。在60歲以上的老年性人群中，腰椎間盤突出、椎管狹窄、韌帶骨化、脊柱腫瘤等一系列脊柱疾病占很高的比例，尤其是韌帶骨化病在脊柱疾患發(fā)病率可高達15%－20%。在一般骨科疾病成人門診中，此病的發(fā)生率可占1%－3%。脊柱韌帶骨化病主要是以硬膜囊周圍韌帶骨化為主，經(jīng)常發(fā)生的有以下幾種疾病:頸椎后縱韌帶骨化(OPLL)、黃韌帶骨化癥、胸椎后縱韌帶骨化癥等。頸椎后縱韌帶骨化是目前臨床經(jīng)常遇見的骨化類型，較其他幾種骨化類型發(fā)病率高。脊柱韌帶在一系列的因子影響下由正常形態(tài)轉(zhuǎn)變成為異常形態(tài)，即脊柱韌帶的異位骨化，導致異位成骨出現(xiàn)。異位骨化的韌帶使椎管變得較為狹窄，使硬膜囊在某點或某節(jié)段受壓，從而脊髓神經(jīng)受壓，形成嚴重的脊髓病［1］。韌帶異位骨化的進一步發(fā)展，在嚴重異位骨化的基礎(chǔ)上能導致截癱，對患者個體造成嚴重的身心疾患，對家庭及社會造成嚴重的經(jīng)濟負擔。本病的病因至今仍不清楚，對于本病的發(fā)病因素仍停留在推測及學說階段，而其他韌帶骨化病的病因也無定論。目前對尋找脊柱韌帶骨化病的致病因子，是防治脊柱韌帶骨化病發(fā)生的最有效的辦法，也為臨床疾病的治療提供新的思路。在眾多分子研究機制中，本文對幾種主要影響脊柱韌帶骨化的分子做一論述。

1 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)的骨化作用

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)是一組多功能細胞因子，其隸屬于轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)超家族。在對間充質(zhì)細胞遷徙、增殖、分化方面有重要的誘導作用，可以導致軟骨和骨形成。另一方面BMPs對骨原細胞的分化也起主要的決定性作用。一系列的研究證明，BMPs是促進成骨的重要因子［2］。Deckers MM［3］與Bouletreau PJ［4］研究發(fā)現(xiàn):利用細胞培養(yǎng)技術(shù)，對成骨細胞、骨髓細胞、間充質(zhì)細胞進行體外培養(yǎng)，在不同階段對BMPs和VEGF的濃度進行測定，發(fā)現(xiàn)在兩者共同存在時其相同階段的某一分子的濃度及表達量要高于單一因素，說明兩者可以相互促進表達。段小軍等［5］在對人骨髓基質(zhì)細胞進行培養(yǎng)時，以牛骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)為誘導劑，發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原、骨鈣素表達明顯增加。此研究結(jié)果表明:體外培養(yǎng)時，天然BMPs對人骨髓基質(zhì)細胞向成骨方向的分化具有重要的作用。在眾多BMPs的實驗研究中，以對BMP－2的研究為主。Chen D等［6］在體內(nèi)和體外實驗研究都表明:BMP－2對成骨細胞分化和誘導體外成骨具有很強的促進作用。Onishi T［7］等認為BMP－2直接作用于成熟的破骨細胞，誘導其骨吸收活性，其認為BMPs在骨形成的各個階段均有不同程度的表達。詹玉林等［8］通過Western blot檢測顯示，在對小面積的(0.5cm)骨缺損部位研究中發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2(BMP－2)的表達在損傷后1、3、4周呈逐漸增多的趨勢，且在每組損傷中BMP－2表達量均較損傷時刻明顯增加。洪亮等［9］構(gòu)建的殼聚糖－磷酸鈣/重組人BMP－2復(fù)合材料也證實了骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2能在兔體內(nèi)異位成骨。

BMP－4和BMP－6也是TGF家族成員。林霖等［10］以小鼠為模型，研究發(fā)現(xiàn)以BMP－4、脫鈣骨基質(zhì)及切斷跟腱三個研究因子為研究對象，三種因子均可有效誘導異位骨化。李林等［11］以攜帶BMP－6腺病毒感染小鼠骨髓基質(zhì)細胞(BMSC)，通過染色和定量檢測堿性磷酸酶(ALP)、骨橋素(OPN)及骨鈣素(OC)，其表達量明顯上升。在基因檢測試驗中，BMP－6對轉(zhuǎn)錄因子Smad和成骨關(guān)鍵基因Runx2的活化中起著重要作用，也能促進小鼠BMSC定向成骨分化。綜上所述，BMPs在骨細胞分化及異位骨化中起著重要的作用。

2 Runx2的骨化作用

Runx家族蛋白包含Runxl、2、3三種異構(gòu)體，都有一DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域runt。果蠅的成對控制基因runt序列與此結(jié)構(gòu)域同源［12］，在多種細胞譜系Runx蛋白發(fā)揮著重要作用。Runxl參與造血干細胞分化。Runx3在胃上皮細胞調(diào)控中發(fā)揮重要作用。而Runx2對成骨具有重要的作用，主要影響成骨細胞分化、軟骨細胞成熟及骨基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生。Runx2基因表達是一種細胞調(diào)控因子，眾多的實驗研究表明，Runx2其一個中樞的作用，幾乎所用的成骨因子都對Runx2具有增強作用，是各種信號傳達發(fā)揮作用的交匯點，在人體成骨中具有重要的地位。轉(zhuǎn)化生長因子β－1(TGFβ－1)可以通過smad與P38、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)兩種途徑來刺激runx2基因，使其表達的runx2蛋白異常升高，促進其在人體的成骨作用，尤其在人體后縱韌帶骨化骨化中起著重要的作用。

Enomoto H等［13］以小鼠為實驗?zāi)Ｐ?，運用目的基因敲除的方法研究Runx2的骨化功能。以Runx2為目的基因，對其實行基因敲除，可以發(fā)現(xiàn)小鼠膜內(nèi)骨化成骨及軟骨內(nèi)骨化成骨均不能發(fā)生，說明Runx2為成骨分化所需的必要因子。

BMPs是骨化及成骨的重要因子，細胞膜上的Ⅰ型和Ⅲ型兩種受體，BMPs能與受體特異性結(jié)合，可通過特異的蛋白(Samd)傳遞信號，發(fā)揮其骨化作用。Samd1、5、8能同Samd4形成復(fù)合物，此復(fù)合物可以激活目的基因促進其表達，從而促進成骨細胞的分化及異位成骨的形成。BMPs調(diào)控成骨細胞基因表達是一個復(fù)雜的過程。研究發(fā)現(xiàn)Samd1、5同Samd4形成的復(fù)合物具有增強子的序列，能同目標基因上的Samds結(jié)合元件結(jié)合，結(jié)合的Samds和其他的核因子能上調(diào)Runx2和osterix(OSX)基因的轉(zhuǎn)錄［14］。

成纖維細胞因子(FGF2)能迅速促進骨髓間充質(zhì)細胞中絲裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)的磷酸化和骨鈣素(OC)mRNA的表達。Nugent MA等［15］對骨髓間充質(zhì)細胞行體外培養(yǎng)，用FGF2處理骨髓間充質(zhì)細胞，檢測到Runx2的磷酸化水平明顯增加，此實驗證明FGF2可實現(xiàn)對Runx2蛋白的磷酸化調(diào)節(jié)，此調(diào)節(jié)過程是通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號途徑來實現(xiàn)的。另外一些實驗研究也具有相同的結(jié)果，Boudreaux JM［16］及MacKenna DA［17］等研究結(jié)果也證明了力學信號的刺激與Runx2磷酸化具有明顯的相關(guān)性。力學信號刺激人和大鼠骨髓間充質(zhì)細胞能激活細胞外信號調(diào)節(jié)細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號途徑，同時拉動了Runx2磷酸化。Nakashima K等［18］依賴細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)激活Runx2基因轉(zhuǎn)錄，ECM能向成骨細胞發(fā)出分化信號，促進成骨細胞分泌骨鈣素，說明Runx2在骨鈣素的轉(zhuǎn)錄過程中起著重要的作用。

綜上所述，Runx2在成骨細胞、軟骨細胞的分化及骨和軟骨的形成具有促進作用，且各個因子的促進骨化作用是以Runx2為樞紐的。

3 LMP－1骨化作用

LIM礦化蛋白(LIM mineralization protein，LMP)是一種細胞內(nèi)的非分泌蛋白，其屬于LIM結(jié)構(gòu)域蛋白家族成員。它能夠影響骨基質(zhì)的礦化，是一種胚胎骨發(fā)育及成骨細胞分化過程中重要的正調(diào)節(jié)因子。LIM結(jié)構(gòu)域是很多LIM蛋白行使其生物學功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，其能介導蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，并參與細胞的增殖和分化。LIM結(jié)構(gòu)域是以Lin11、Isl－1、Mec－3三種同源蛋白質(zhì)中的首字母命名。LIM結(jié)構(gòu)域是一種含有55個氨基酸殘基的序列，是由保守的組氨酸、半胱氨酸殘基形成“口袋”狀穩(wěn)定的三級結(jié)構(gòu)，其氨基酸序列為CX2CX16－23HX2CX2－CX2CX16－23CX2C(X代表其它氨基酸)，能夠與Zn+結(jié)合［19，20］。

LIM結(jié)構(gòu)域蛋白家族包含許多蛋白分子，LMP－1為其中一種。Boden SD等［21］在研究骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)促進骨形成機制過程中，利用糖皮質(zhì)激素刺激小鼠成骨細胞mRNA，并以反轉(zhuǎn)錄差異顯示技術(shù)(DDRT－PCR)作為反應(yīng)體系，同時設(shè)立對照組，在此體系反應(yīng)過程中得到一種全新的cDNA片段，此cDNA片段部分基因區(qū)可以翻譯并編碼一種新的蛋白質(zhì)。這種蛋白含有457個氨基酸，此蛋白質(zhì)含有兩個糖基化位點和多個翻譯后修飾位點，其C端和N端分別含有LIM結(jié)構(gòu)域和PDZ結(jié)構(gòu)域( PDZ結(jié)構(gòu)域是識別靶蛋白C端最末4－7個氨基酸的小球形結(jié)構(gòu)域)，這種蛋白被稱為LIM礦化蛋白－1。Viggeswarapu M等［22］利用腺病毒載體轉(zhuǎn)導實驗發(fā)現(xiàn)人體包含3種不同的LIM基因型。不同基因型的LMP在人體不同組織器官表達量是不同的，即使在同一組織器官的不同部位表達量也是不同的。LMP－1和LMP－2在人體大多數(shù)組織器官幾乎均能表達。其中LMP－1在脾、肺、粒細胞等組織器官中的表達占有主導地位，骨骼肌中的LMP－2表達相對較高，而組織中的LMP－3表達范圍比較局限。上述表達情況說明:在不同的組織器官中不同類型基因的表達及表達量可能存在不同的作用，并可能隨組織分化和功能變化而表達不同基因類型表達量［23］。Bunger MH等［24］利用RT－PCR技術(shù)以人髂骨為標本，應(yīng)用半定量分析的方法得到:LMP－1表達水平在年輕個體中高于LMP－2，此研究結(jié)果表明人類生長發(fā)育與LMPs的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)可能有密切的聯(lián)系;LMP－2的表達和許多生長因子有關(guān)，尤其與BMP－2和bFGF關(guān)系更為密切。

LMP－1是一種胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導分子，在對胚胎骨發(fā)育的過程中的研究發(fā)現(xiàn):肥大的軟骨細胞被間充質(zhì)細胞所包圍，在這些間充質(zhì)細胞中發(fā)現(xiàn)了一些LMP－1的轉(zhuǎn)錄物，說明LMP－1在成骨細胞早期分化中明顯相關(guān)［20］。通過明前的實驗研究，一些學者對LMP－1的作用持有不同的觀點:LMP－1不能直接作為成骨及骨化誘導因子，而是通過刺激其它骨誘導分子(如BMPs)的合成及分泌發(fā)揮作用［25］。Boden SD［21］等對大鼠研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素及BMP－6可以誘導LMP－1分泌，促進礦化結(jié)節(jié)的形成;過量表達的LMP－1又可以促進大鼠成骨細胞分泌BMP－2和成骨細胞的重要轉(zhuǎn)錄因子cbfa1;在通過對轉(zhuǎn)染pCMV－LMP－1質(zhì)粒7d后，BMP－2 mRNA及蛋白水平比原始水平提高數(shù)倍甚至數(shù)十倍;同樣cbfa1 mRNA水平也比原始高于數(shù)個水平。Minamide A等［26］利用腺病毒載體Ad LMP－1將含LMP－1序列轉(zhuǎn)染人肺癌細胞系。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后多種骨形態(tài)發(fā)生蛋白(如BMP－6)及TGF－B1蛋白的表達明顯升高;LIM礦化蛋白－1同樣可誘導多種BMPs表達，體外實驗證明LIM礦化蛋白－1轉(zhuǎn)入48h后就能檢測到BMP－4、BMP－7，同時在體內(nèi)實驗也證明LIM礦化蛋白－1轉(zhuǎn)72h后也能檢測到BMP－4、BMP－7。Yoon ST等［27］研究表明，以病毒攜帶LMP－1轉(zhuǎn)染椎間盤細胞，BMP－2及BMP－7持續(xù)分泌，蛋白表達量明顯上升，蛋白聚糖含量增加。

牙本質(zhì)和骨組織有相同的間充質(zhì)起源和組織形成過程。他們的起源及形成過程都包含細胞的分化、細胞外基質(zhì)的分泌和礦化［28］。王效英、張旗等［29，30，31］利用基因擴增技術(shù)(RT－PCR)檢測LMP－1及其相關(guān)因子(BMP－2、BMP－6、BMP－7、Cbfa1)在人牙髓細胞的分化及礦化結(jié)節(jié)的形成過程中的表達情況。發(fā)現(xiàn)它們在不同的分化階段表達量均呈上升趨勢。此體外實驗的進一步研究，為下一步的人牙髓細胞的分化及礦化結(jié)節(jié)提供了良好的理論依據(jù)及實驗室基礎(chǔ)。此外，在牙周膜細胞體外實驗中，礦化結(jié)節(jié)的形成顆粒的多少、骨涎蛋白及堿性磷酸酶的表達量明顯高于對照組。另外，一系列體內(nèi)外實驗研究表明［29，30，31，32］LMP－1在正常及病理狀態(tài)下的牙本質(zhì)及牙周膜細胞中均有表達，可以推測LMP－1在此種過程中發(fā)揮著重要的作用。Sangadala S等［33］的研究表明LMP－1可以與Smads泛素化調(diào)控因子1(Smad ubiquitin gulatory factor 1，Smurf1)相互作用，抑制Smads的普遍表達性。在LMP－1介導的骨形成區(qū)域，有1個可以直接與Smurf1－WW2結(jié)構(gòu)域相互作用的區(qū)域，該區(qū)域可以有效地與Smad1、Smad5競爭性結(jié)合。LMP－1通過Smurf1－WW2域相互作用來阻斷Smurf1與Smad的結(jié)合，從而導致細胞對外源性BMPs的敏感度增加，有效地促進了骨形成，為LMP－1及BMPs信號路徑的調(diào)控機制提供了新的理論。

綜上所述，胞內(nèi)信號分子LMP－1可能促進細胞分泌多種細胞因子(如BMPs)，同時也使周圍許多細胞加入骨化行列。即使細胞表達相對較少的LMP－1也可以有效地促進骨形成，通過放大效應(yīng)來發(fā)揮作用。根據(jù)以上實驗研究結(jié)果，LMP－1在骨形成及骨化中起著重要的作用，同時也為LMP－1對后縱韌帶骨化的形成機制提供了一個新的思路。

4 其他因子的骨化作用

在一系列實驗研究過程中，發(fā)現(xiàn)骨骼的生長發(fā)育過程中受到多種因子的調(diào)控(如雌激素、甲狀旁腺素、維生素D、堿性磷酸酶、胰島素)。在許多OPLL的患者同時伴有上述激素水平表達比較混亂時，OPLL骨化更為明顯。Horikoshi T［34］實驗證實在OPLL周邊軟骨細胞中發(fā)現(xiàn)，IGF－1表達水平較高，其可促進軟骨細胞骨化及細胞外基質(zhì)形成。

目前對后縱韌帶骨化作用的研究還包括許多因子，如易感基因、機械刺激、酶等，研究發(fā)現(xiàn)它們與細胞分化、成骨及異位骨化有密切關(guān)系，但在眾多關(guān)系中主要因子的分子機制目前還不清楚，需進一步研究。

5 結(jié)語

目前對于后縱韌帶異位骨化的作用機制取得了重大的進展，但對于許多作用機制還不甚了解，或者某一機制不能全面概括異位成骨的步驟。因此，多因素多層次導致了后縱韌帶骨化，目前以分子作用機制來探討發(fā)病機制，從根本上來預(yù)防本疾病的發(fā)生，也為本病的治療提供先決條件。

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R686

:A

:7115-1004(2015)06-0714-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.06.047

2015－1－13)

孔德謙，泰山醫(yī)學院在讀碩士。

蔡國棟。