穩(wěn)定高表達CYP2E1基因肝癌HepG2細胞系的構建

熊永福，閆再華，楊召，李敬東(川北醫(yī)學院，四川南充 637007；川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

穩(wěn)定高表達CYP2E1基因肝癌HepG2細胞系的構建

熊永福1，閆再華1，楊召1，李敬東2(1川北醫(yī)學院，四川南充 637007；2川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

摘要：目的 構建穩(wěn)定高表達CYP2E1基因的肝癌HepG2細胞系。方法通過NCBI查詢CYP2E1的編碼序列，設計并構建表達質(zhì)粒pLV(Exp)-Puro-CMVm-CYP2E1，用載體對應的慢病毒包裝質(zhì)粒(pMDLg/pRRE、pRSV-REV和pMD2.G)共同轉(zhuǎn)染293T細胞。利用攜帶CYP2E1基因的慢病毒(Lenti-CYP2E1-eGFP-Puro)感染HepG2細胞系，采用嘌呤霉素抗性篩選方法構建高表達CYP2E1肝癌HepG2細胞系。增強綠色熒光蛋白檢測轉(zhuǎn)染情況，熒光定量PCR及Western blotting檢測HepG2、空載及轉(zhuǎn)染CYP2E1基因的HepG2細胞系中CYP2E1 mRNA和蛋白。結果HepG2細胞系均成功轉(zhuǎn)染CYP2E1基因。HepG2、空載及轉(zhuǎn)染CYP2E1基因的HepG2細胞系中CYP2E1 mRNA相對表達量分別為1.02±0.06、1.06±0.05、7.42±0.07，蛋白相對表達量分別為0.26±0.02、0.29±0.01、1.61±0.08，轉(zhuǎn)染CYP2E1基因的HepG2細胞系與前兩者比較，P均<0.05。結論通過慢病毒轉(zhuǎn)染成功構建了穩(wěn)定高表達CYP2E1基因的肝癌HepG2細胞系。

關鍵詞：CYP2E1基因；慢病毒載體；肝癌；HepG2細胞

原發(fā)性肝癌是臨床常見的高致命性癌癥。美國癌癥中心數(shù)據(jù)顯示2014年全美新增肝膽癌患者33 190例，占所有新增腫瘤患者的2.0%。近10年肝癌發(fā)病率以每年4.2%的速度遞增。雖然影像檢查與外科技術的迅猛發(fā)展使得大部分肝癌患者可以接受手術治療，也使其5年生存率由3.0%提高到了16.8%[1]。但由于該病起病隱匿、進展迅速、易轉(zhuǎn)移復發(fā)，病死率依然高居惡性腫瘤第2位[2]。因此，研究肝癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移機制，尋找關鍵信號通路作為治療靶點，從而提出新的防治措施是當務之急。細胞色素P450 2E1(CYP2E1)是肝臟的重要代謝酶，參與肝病和肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展，并可通過增加花生四烯酸(AA)等環(huán)節(jié)參與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移[3]。對CYP2E1的研究有助于尋找治療肝癌的新靶點。本研究旨在通過慢病毒載體在HepG2細胞系中實現(xiàn)CYP2E1基因的持續(xù)穩(wěn)定高表達，為深入研究CYP2E1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1主要試劑、質(zhì)粒和細胞人肝癌HepG2細胞系、慢病毒載體pLVX及包裝質(zhì)粒pMDLg/pRRE、pRSV-REV和pMD2.G由阿爾伯特·愛因斯坦醫(yī)學院宗海紅教授惠贈；大腸桿菌DH5α細胞由川北醫(yī)學院風濕免疫研究所惠贈；人正常肝細胞L02細胞系由川北醫(yī)學院肝膽胰腸研究所保存；用于慢病毒包裝的293T細胞株購自ATCC公司(USA)；TRIzol RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司(USA)；質(zhì)粒小量提取和無內(nèi)毒素質(zhì)粒中量提取試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司；ImProm-ⅡTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司(USA)；胎牛血清及各種培養(yǎng)液分別購自Hyclone公司和Sigma公司(USA)；CYP2E1抗體(Anti-Cytochrome P450 2E1 antibody)購自英國ABCAM公司。

1.2細胞培養(yǎng)HepG2細胞系、L02細胞系培養(yǎng)于加入10%小牛血清(Gibco，USA)的DMEM(Hyclone，USA)培養(yǎng)基中。細胞均常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)[4]。

1.3CYP2E1基因慢病毒轉(zhuǎn)染HepG2細胞系查詢CYP2E1的編碼序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，通過NEBcutter V2.0(http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php)檢測序列的特異性核酸內(nèi)切酶位點。以L02中所獲得的cDNA為模板，利用PlatinumRTaq高保真DNA聚合酶(Invitrogen，USA)通過PCR擴增得到帶有XmaⅠ酶切位點的CYP2E1編碼序列，將CYP2E1序列連接入pLVX[pLV(Exp)-Puro-CMVm-CYP2E1]的相應位點之間得到重組質(zhì)粒pLVX，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，進行陽性克隆篩選并經(jīng)測序(Invitrogen公司)證實。擴增并收集測序正確的重組質(zhì)粒pLVX載體，用pLVX載體對應的慢病毒包裝質(zhì)粒(pMDLg/pRRE、pRSV-REV和pMD2.G)共同轉(zhuǎn)染293T細胞。將加入上述質(zhì)粒共培養(yǎng)的293T細胞置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。48 h后吸取培養(yǎng)基并用0.45 μm濾膜過濾，收集病毒上清。使用Lenti-X GoStix試劑盒測定病毒滴度。編號后將病毒上清保存于-80 ℃冰箱。將沒有插入CYP2E1基因片段的載體作為空載對照。取生長狀態(tài)良好的HepG2，消化后細胞計數(shù)板計數(shù)。按1×105/瓶的HepG2細胞接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中。置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)12 h，待細胞全部貼壁，鋪板到50%左右。預先37 ℃水浴解凍攜帶CYP2E1基因的慢病毒(Lenti-CYP2E1-eGFP-Puro)病毒上清，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基對半稀釋，加入人嘌呤霉素至終濃度為6 μg/mL。吸出原瓶中培養(yǎng)基，PBS漂洗2次，加入上述含病毒培養(yǎng)基培養(yǎng)。24 h后換正常的DMEM完全培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h，同時將嘌呤霉素濃度調(diào)整至4 μg/mL對細胞進行篩選，2 d換液1次，篩選6 d。將沒有插入CYP2E1基因片段的HepG2細胞系作為空載對照細胞。

1.4穩(wěn)定高表達CYP2E1基因HepG2細胞系的鑒定

1.4.1CYP2E1檢測采用增強綠色熒光蛋白(eGFP)測定。轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡檢測重組質(zhì)粒pLVX中的綠色熒光蛋白eGFP表達情況，以證實eGFP-Puro-CYP2E1成功整合到HepG2細胞系基因組中，并表達eGFP蛋白。于轉(zhuǎn)染后2、4、6 d分別檢測熒光蛋白表達情況。經(jīng)傳代培養(yǎng)后凍存，3個月后復蘇并于復蘇后2、4、6 d觀察熒光情況。

1.4.2CYP2E1 mRNA檢測采用熒光定量PCR檢測。分別接種HepG2、空載及轉(zhuǎn)染CYP2E1基因的HepG2細胞系至6孔板(約1×105個)，培養(yǎng)細胞約24 h，細胞密度達到80%左右。按照RNA提取試劑盒說明書，用RNeasy Mini Kit提取細胞總RNA，Nanodrop2000測定濃度及純度。用PrimeSeript RT reagent Kit將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取上述3種細胞的cDNA各1 μL為模板進行熒光定量PCR，檢測CYP2E1 mRNA的表達。

1.4.3CYP2E1蛋白檢測取生長狀態(tài)良好，細胞密度90%左右的正常HepG2、空載及轉(zhuǎn)染CYP2E1基因的HepG2細胞系。吸棄培養(yǎng)基，冷PBS漂洗3遍，吸盡培養(yǎng)瓶(25 cm2)殘液后加入200 μL細胞裂解液，冰上孵育3 min后用細胞刮迅速刮下，吸入500 μL EP管中，然后將EP管置于冰上繼續(xù)裂解30 min，12 000 r/min、4 ℃離心15 min。取上清液采用BCA法測定蛋白濃度，然后加入5×SDS-PACE上樣緩沖液，100 ℃變性5 min。每組樣品取總蛋白60 μg，10%SDS-PACE電泳分離，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉(TBST溶解)室溫封閉2 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜(約12 h)，第2天用TBST洗膜3次(每次10 min)，再加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次(每次10 min)后，加入Western blotting化學發(fā)光試劑后用GE冷CCD成像系統(tǒng)對其進行曝光拍照，所得圖像用Image J軟件進行條帶灰度定量分析。以GAPDH為內(nèi)參，檢測三者CYP2E1蛋白表達水平。

2結果

eGFP-Puro-CYP2E1成功轉(zhuǎn)入HepG2細胞系，并表達熒光蛋白。復蘇后2、4、6 d所檢測到的熒光強度有所減弱，但表達率仍接近100%。詳見插頁Ⅱ圖5。HepG2、空載及轉(zhuǎn)染CYP2E1基因的HepG2細胞系中CYP2E1 mRNA相對表達量分別為1.02±0.06、1.06±0.05、7.42±0.07，蛋白相對表達量分別為0.26±0.02、0.29±0.01、1.61±0.08，轉(zhuǎn)染CYP2E1基因的HepG2細胞系與前兩者比較，P均<0.05。

3討論

基因過表達技術是通過不同途徑將外源基因?qū)氚屑毎蛊浔磉_相應蛋白質(zhì)，從而實現(xiàn)對基因(或蛋白質(zhì))功能的研究[5]?；?qū)氲幕痉椒ㄖ饕谢瘜W法、物理法和生物法。然而理化方法簡單粗暴、轉(zhuǎn)染效率低，對細胞損傷明顯，且不能實現(xiàn)目的基因的持續(xù)穩(wěn)定表達，局限了其應用范圍[6]。而以慢病毒轉(zhuǎn)染為代表的生物法，既可以提供高效的基因轉(zhuǎn)染又可以實現(xiàn)長期穩(wěn)定的基因表達。尤其是以Ⅰ型人類免疫缺損病毒(HIV-1)為代表的慢病毒[7,8]。但該方法步驟繁瑣復雜，技術難度較大，具有潛在生物危害。本研究為構建持續(xù)穩(wěn)定高表達CYP2E1基因的HepG2細胞系，實現(xiàn)真正的目的基因與自身遺傳物質(zhì)整合，減少外源基因?qū)Ψ腔蛳嚓P特性的影響，最大限度保留HepG2自身生物學特性，采用了HIV-1為基礎構建的慢病毒載體系統(tǒng)，這也是目前較為理想的基因轉(zhuǎn)染載體[9,10]。

細胞色素P450為肝臟主要代謝酶，該酶系有100多種同工酶，CYP2E1約占其總量的7%。雖然CYP2E1不是藥物的主要代謝酶，但參與環(huán)境致癌物代謝，在多種癌癥易感性中起重要作用[11]。Caro等[12]研究證實：CYP2E1通過Ca2+-磷脂酶A2(PLA2)的激活加劇AA的產(chǎn)生并直接參與AA代謝，而AA在環(huán)氧合酶2(COX-2)的作用下轉(zhuǎn)化前列腺素E2，后者導致EGFR/Met信號激活引起肝癌侵襲轉(zhuǎn)移。CYP2E1作為代謝酶不僅通過其代謝過程中的各種底物與產(chǎn)物參與細胞功能調(diào)節(jié)，我們課題組的研究[13]還表明CYP2E1本身就能夠促進肝癌轉(zhuǎn)移復發(fā)?？莘窦毎?KCs)約占肝臟細胞的15%，是最重要的肝癌相關巨噬細胞。我們的研究證實CYP2E1可以直接通過HIF-1α介導KCs基因表達和功能轉(zhuǎn)化。而KCs的功能轉(zhuǎn)化在肝癌的細胞維持、免疫逃逸和轉(zhuǎn)移復發(fā)過程中扮演了極其重要的作用?？梢姡珻YP2E1有望成為防治肝癌的新靶點。

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Establishment of hepatocellular carcinoma cell line HepG2 stably over-expressing CYP2E1

XIONGYong-fu1,YANZai-hua,YANGZhao,LIJing-dong

(1NorthSichuanMedicalUniversity,Nanchong637000,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a hepatocellular carcinoma cell line HepG2 which highly expressing CYP2E1 stably. MethodsThe coded sequence (CDS) of CYP2E1 was searched in NCBI website, and lentiviral vector (pLV(Exp)-Puro-CMVm- CYP2E1) was designed and constructed. 293T cells were co-transfected with the vector corresponding lentiviral packaging plasmid (pMDLg/pRRE, pRSV-REV and pMD2.G). Lentiviral (Lenti-Cyp2e1-eGFP-Puro) carrying CYP2E1 gene was used to trasfect HepG2 cell line, and puromycin-resistance screening were performed to establish the HepG2 cell line that highly expressed CYP2E1. The transfection was detected through enhanced green fluorescent protein, q-PCR and Western blotting was used to detect the expression of CYP2E1 mRNA and protein in HepG2, no-load HepG2 cell line and HepG2 cell line transfected by CYP2E1 gene. ResultsHepG2 cell line all transfected CYP2E1 gene successfully. The relative expression of CYP2E1 mRNA in HepG2, no-load HepG2 cell line and HepG2 cell line transfected by CYP2E1 gene was 1.02±0.06, 1.06±0.05 and 7.42±0.07, the protein expression of each group was 0.26±0.02, 0.29±0.01 and 1.61±0.08 respectively. HepG2 cell line transfected by CYP2E1 gene had significant differences as compared with the former two groups (all P<0.05).ConclusionThe hepatocellular carcinoma cell line HepG2 stably and highly expressing CYP2E1 gene is successfully constructed by lentiviral transfection.

Key words:CYP2E1 gene; lentiviral vector; liver carcinoma; HepG2 cells

(收稿日期：2014-12-24)

通信作者簡介：李敬東(1970-)，男，教授，主要研究方向為肝臟疾病的基礎與臨床研究。E-mail:lijingdong358@126.com

作者簡介：第一熊永福(1989-)，男，住院醫(yī)師，主要研究方向為肝癌的基礎研究。E-mail:xyf-eva@hotmail.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81370531)。

中圖分類號：R73

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)07-0008-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.07.003