兩類外源刺激對啤酒廢酵母發(fā)酵產谷胱甘肽的影響

萬紅貴，鄧春亞，譚海濤，龔寅聰

1(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京，210009)

2(南京工業(yè)大學國家生化中心，江蘇南京，211816)

三肽物γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸或稱谷胱甘肽(GSH)，是細胞內合成的最重要的低分子量抗氧化劑。谷胱甘肽在許多生命活動中起著直接或間接的作用，這些作用包括自然抗氧化劑、對細胞的保護、氨基酸轉運、免疫功能調節(jié)、促進糖類、脂肪及蛋白質代謝等作用［1］，也能影響細胞的代謝過程，大量應用于醫(yī)藥保健、護膚美容、食品添加等行業(yè)［2-3］，近年來谷胱甘肽廣泛應用于惡性腫瘤、HIV、急性中毒、化療、肝損傷、腎病綜合征等多種疾病輔助治療［4-6］。

目前，谷胱甘肽的生產方法主要以酶法和發(fā)酵法為主，與發(fā)酵條件和工藝流程的優(yōu)化相關的研究尤為突出。前體氨基酸的添加［7］、表面活性劑的使用［8］、乙醇濃度的控制［9］、葡萄糖的流加等方案的設計大大提高了發(fā)酵法產谷胱甘肽的效率。但是絕大部分的發(fā)酵法產谷胱甘肽采用的都是常規(guī)菌種進行正常發(fā)酵，耗時耗力，不宜進行工業(yè)化。本文選取廢酵母為研究對象，由于縮短了發(fā)酵耗時并降低了生產成本，谷胱甘肽的生產效率得到顯著地提升。此外，對發(fā)酵過程中的菌體實施外援刺激以加速谷胱甘肽的合成的相關報道也并不多見。本文就氧化刺激和高滲刺激2個方面探討了這2類刺激物對啤酒廢酵母發(fā)酵產谷胱甘肽的影響。

1 材料和方法

1.1 菌種

啤酒廢酵母:南京金陵啤酒廠提供。

1.2 培養(yǎng)基(g/L)

葡萄糖 25，蛋白胨 10，KH2PO41，K2HPO41，Mg-SO42.5，CaCl20.3，F(xiàn)eSO40.05，pH 5.5。

1.3 培養(yǎng)方法

按10 g/100 mL的接種量將抽濾得到的濕酵母接入用無菌水配制的上述培養(yǎng)基中，裝液量40 mL/500 mL，30℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)24 h。在培養(yǎng)4 h后，加入少量前體氨基酸。

1.4 樣品的處理

取一定體積的發(fā)酵液，5 500 r/mmin離心8 min，上清液用于殘?zhí)堑臏y定，菌體用蒸餾水洗滌2次，加入40%的乙醇溶液30℃萃取2 h。5 500 r/min離心，萃取液適當稀釋后作為谷胱甘肽的測定樣品，離心獲得的酵母菌體105℃烘干至恒重測生物量。

1.5 分析方法

殘?zhí)堑臏y定:DNS法測定殘?zhí)菨舛龋?0］。

谷胱甘肽含量的測定:DTNB 法［11］、ALLOXAN法［12］。

生物量:將離心獲得的酵母菌體105℃烘干至恒重，稱得干菌體的質量，作為菌體生長情況的量化指標。

谷胱甘肽合成酶系酶活［13］:將離心收集后的濕菌體1 g用磷酸緩沖液5 mL懸浮，超聲波90 kHz破碎8 min，加入10 mL酶轉化反應液(谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸各 20 mmol/L，MgSO425 mmol/L，ATP 5 mmol/L)，37℃反應30 min，酶活單位定義為每分鐘催化合成1 μg GSH所需的酶量。

1.6 實驗方案的確定

氧化刺激:選取H2O2和KMnO4兩種氧化劑對發(fā)酵過程中的酵母細胞進行氧化刺激，測定酵母細胞的生長情況、谷胱甘肽的產量。比較各項參數(shù)，確定這兩種物質的最適添加濃度和最適添加時間。

高滲刺激:以NaCl和KCl兩種試劑給發(fā)酵中的酵母細胞以高滲環(huán)境，測定酵母細胞的生長情況、谷胱甘肽的產量及谷胱甘肽合成酶系酶活，確定最適濃度和最佳添加時間。

2 結果與討論

2.1 氧化刺激物對谷胱甘肽產量的影響

2.1.1 氧化刺激物對酵母細胞生長及谷胱甘肽產量的影響

由于培養(yǎng)基中的葡萄糖在前9 h內基本耗光，細胞的生長趨于緩慢，谷胱甘肽的大量合成發(fā)生在細胞生長的中后期。因此，初步選擇發(fā)酵后9 h為氧化刺激物的添加點，確定選擇的刺激物對谷胱甘肽的生產是否有增產效果。由圖1和圖2可以看出雖然2種氧化劑對細胞的生長有一定的抑制作用，但卻都能明顯地提高谷胱甘肽的含量。這是因為在氧化應激條件下，細胞啟動防御保護機制，產生較多的抗氧化劑。而對于酵母細胞來說，體內的谷胱甘肽系統(tǒng)是保護細胞免受氧化劑損傷的主要機制［14］。

2.1.2 氧化刺激物的最佳添加量和添加時間

由圖3和圖4可以看出，無論是KMnO4還是H2O2都只能在一定濃度范圍內提升谷胱甘肽產量。氧化刺激物濃度過高，不僅菌體的生長會受到抑制，而且生產的谷胱甘肽會大量消耗用于保護細胞，使得谷胱甘肽的產量迅速下降。由圖可以看出當KMnO4濃度在0.012 g/L左右、過氧化氫濃度在30 mmol/L左右時，廢酵母產谷胱甘肽的產量達到最大。

在確定了2種氧化刺激物的最佳添加濃度后，在此基礎上繼續(xù)探討了這2種物質發(fā)酵過程中的最佳添加時間。由于前9 h是酵母細胞的快速生長期，為了避免刺激物的添加阻滯細胞的生長引起后期谷胱甘肽合成受阻，因此將添加時間設計在9 h后。由圖5和圖6可以看出，對于KMnO4而言，添加時間越靠后越好，當添加時間為21 h時谷胱甘肽產量和比酶活均達到最大，產量高達512 mg/L，增產20%。而就H2O2來說，酶活和谷胱甘肽產量在發(fā)酵后12 h最大，此刻才是最佳的添加時間，產量達482.3 mg/L，增產13%。

2.2 高滲刺激對谷胱甘肽產量的影響

除了氧化劑會刺激酵母細胞，使得細胞產生應激反應，生成相應的保護性物質。給予細胞高滲環(huán)境，也有產生類似的效果。本實驗選取KCl和NaCl兩種鹽溶液為細胞營造高滲環(huán)境，探索其對酵母細胞產谷胱甘肽的影響。

2.2.1 KCl和NaCl溶液對細胞生長及谷胱甘肽產量的影響

一定濃度的滲透處理對谷胱甘肽的產量會有所提高，但濃度過高會引起細胞脫水、質壁分離甚至死亡，阻礙細胞的正常生理功能，進而影響谷胱甘肽的產量。由圖7可以看出當KCl和NaCl兩種溶液在發(fā)酵液中的濃度為15 g/L時，谷胱甘肽的產量達到最大，高達458.3 mg/L，相比未添加鹽溶液時的428.5 mg/L，產量有所提升。其中，KCl的增產效果要明顯好于NaCl，可能因為KCl中含有K+，該離子是許多酶的激活劑，有利于刺激谷胱甘肽合成中的相關酶類。鑒于KCl的效果要好于NaCl，后期選擇前者做進一步研究。

2.2.2 KCl溶液的最佳添加時間

由圖8可以看出，在發(fā)酵15 h后添加15 g/L的KCl，谷胱甘肽產量、酶活均達到最大。分析可能是該時間段是谷胱甘肽酶系大量合成的關鍵時期，KCl的加入進一步刺激了酶的合成，谷胱甘肽產量明顯增高。此時，谷胱甘肽產量達到475.2 mg/L，相比對照增產11.5%。

2.3 兩種刺激物的聯(lián)合使用

為了確定這兩類刺激物是否具有疊加效應，現(xiàn)將兩類物質聯(lián)合使用，分別考察了KMnO4和H2O2與KCl聯(lián)用時的增產效果。如圖9所示。

由圖9可以看出，兩類刺激物聯(lián)用并沒有產生疊加效應，相反比起單用還略有下降。經(jīng)分析，可能是因為雖然刺激物可以促使細胞啟動防御機制產生谷胱甘肽，但同時過強的刺激也會加速產生的谷胱甘肽的消耗，從而使得增產效果大打折扣。

3 結論

綜合上述實驗結果，我們發(fā)現(xiàn)氧化和高滲刺激都能一定程度地增加谷胱甘肽的產量。前者是因為氧化劑會促使細胞發(fā)生保護性反應，產生抗氧化物質;后者是因為高滲環(huán)境改變了細胞的生理功能，刺激了谷胱甘肽相關酶系的活性。本實驗中，發(fā)酵21 h后添加0.012 g/L的KMnO4，谷胱甘肽的產量高達512 mg/L，增產20%;H2O2的最佳添加時間為發(fā)酵后12 h，最佳添加濃度為30 mmol/L左右，谷胱甘肽產量可達482.3 mg/L，增產13%;發(fā)酵15 h后用15 g/L的KCl溶液進行高滲刺激，谷胱甘肽產量提升至475.2 mg/L。兩種類型的刺激物單獨使用的效果要強于聯(lián)合使用，單獨使用KMnO4，谷胱甘肽的產量最高。

［1］ Mary E A.Glutathione:an overview of biosynthesis and Modulation ［J］.Chem Biol Interact，1998，11(2):1.

［2］ Yanping T，Wen J，Na G，et al.Inhibitory effects of glutathione on dengue virus production［J］.Biochem Bioph Res Co，2010，397(3):420.

［3］ LI Y，WEI G Y，CHEN J.Glutathione:a review on biotechnological production［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2004，66(3):233.

［4］ Dringen R G J，Hirlinger J.Glutathione metabolism in the brain［J］.Biochem，2000，267(16):4912-4916.

［5］ Micke P B K，Schlaak JF，Buhl R.Oral supplementation with whey proteins increases plasma glutathione levels of HIV-infected patients［J］.Clin Invest，2001，31(2):171-178.

［6］ Roum J H，Buhl R，McElvaney N G，et al.Systemic deficiency of glutathione in cystic fibrosis［J］.Appl Physiol，1993，75(6):2419-2424.

［7］ WANG Z，TAN T W，SONG J.Effect of amino acids addition and feedback control strategies on the high-cell-density cultivation of Saccharomyces cerevisiae for glutathione production［J］.Process Biochem，2007，42(1):108.

［8］ WEI G，LI Y，DU G，et al.Effect of surfactants on extracellular accumulation of glutathione by Saccharomyces cerevisiae［J］.Process Biochem，2003，38(8):1 133.

［9］ WEN S H，ZHANG T，TAN T W.Maximizing production of glutathione by amino acid modulation and high-cell-density fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae［J］.Process Biochem，2006，41(12):2 424.

［10］ 張惟杰.糖復合物生化研究技術［M］.杭州:浙江大學出版社，1994:10.

［11］ T IETZE F.Enzymic method for quantitative determination of nano gram amounts of total and oxidized glutathione［J］.Anal Biochem，1969，27(3):502-522.

［12］ 趙少欣，賀小賢.還原型谷胱甘肽簡便測定法［J］.食品科技，2007，191(9):219-220.

［13］ 沈立新、魏東芝.谷胱甘肽合成酶系的克隆、測序及表達［J］. 生物工程學報，2001，17(1):98-100.

［14］ LIANG G B，LIAO X Y，DU G C，et al.A new strategy to enhance glutathione production by multiple H2O2-induced oxidative stresses in Candida utilis［J］.Bioresource Technol，2009，100(1):350.