小麥低聚肽對體外腸上皮細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用*

張亞卓，姜思萌，魏穎，馬勇，王向紅，谷瑞增，曹珂璐

1(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定，071001)2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)

3(北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京，100015)

小腸上皮細胞是人體主要的防御屏障，它能夠阻止腸腔內(nèi)有害物質(zhì)進入血液循環(huán)或其他組織器官。腸黏膜損傷的上皮細胞可引起炎癥、有害物質(zhì)通過率增加、黏膜損傷甚至細菌移位，重者可以導(dǎo)致多器官功能衰竭或膿毒癥。大量研究證實，小腸上皮的損傷及其導(dǎo)致的腸黏膜屏障功能受損在一系列腸道受損疾病發(fā)病機制中起主要作用，如炎癥性腸?。?-2］、梗阻性黃疸［3］、急性胰腺炎［4］、酒精性肝病［5］等。引起腸黏膜屏障功能破壞的因素主要有氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等，以往的研究表明，過氧化氫(H2O2)能夠引起腸上皮氧化應(yīng)激并導(dǎo)致屏障功能破壞［2，4，6-8］。Caco-2細胞源于人結(jié)腸腺癌細胞，在正常培養(yǎng)條件下其結(jié)構(gòu)和功能類似于分化小腸上皮細胞，可形成與小腸相似的緊密連接，具有微絨毛、含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶系［9-10］，是體外研究腸上皮損傷修復(fù)作用的最佳模型［11］。

近年來，天然安全且具有生理活性的物質(zhì)越來越受到人們的關(guān)注，生物活性低聚肽因具有較強的生物活性和很高的生物安全性而成為國內(nèi)外的研究重點。以往對低聚肽的研究以抗氧化、提高免疫力、降血壓、清除膽固醇等居多，并且以海洋膠原肽［12］、玉米低聚肽［13］、大豆活性肽［14］等為研究對象，對于小麥肽的研究相對較少。近年來，關(guān)于小麥低聚肽實驗表明，小麥低聚肽具有多種生物學(xué)功能，如抑癌活性［15］、阿片活性［16-17］、抑制 ACE 活性［18-19］等，關(guān)于小麥肽對體外腸上皮損傷修復(fù)的研究目前尚無報道。因此本研究以Caco-2細胞為對象探討小麥低聚肽對Caco-2細胞氧化應(yīng)激損傷修復(fù)的影響，旨在闡明小麥低聚肽的腸黏膜損傷修復(fù)活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料

小麥低聚肽，北京中食海氏生物技術(shù)有限公司;Caco-2細胞、MEM培養(yǎng)基、細胞消化液，北京協(xié)和細胞資源中心;胎牛血清，NEAA，Hepes，Gibco;苯酚紅、PBS緩沖液、乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒、總SOD活性檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒，購于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.2 儀器

Spectra MR多功能酶標儀，美國dynex;生物安全柜，新加坡藝思高科技;CO2培養(yǎng)箱，美國thermofisher;顯微鏡CKX 41，日本Olympus;流式細胞儀Accuri C6，美國 BD。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

Caco-2細胞培養(yǎng)條件為:37℃，5%CO2，培養(yǎng)液為:含10%胎牛血清、1%Hepes、1%谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的MEM培養(yǎng)液，待細胞融合至培養(yǎng)瓶的90%時，棄培養(yǎng)液，用PBS沖洗，加入適量的消化液，按照1∶3傳代培養(yǎng)。取處于對數(shù)期、生長狀態(tài)良好的細胞用于實驗。

1.2.2 小麥低聚肽溶液制備及實驗分組

用PBS將小麥低聚肽粉配制成濃度為100 mg/mL的母液，0.22 μm濾膜過濾除菌，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。將實驗細胞隨機分為5組:對照Ⅰ(空白組0μmol/L H2O2)、對照Ⅱ(氧化應(yīng)激組 100 μmol/L H2O2)，處理Ⅰ、處理Ⅱ、處理Ⅲ(分別在對照組Ⅱ的條件下添加1、5、10 mg/mL小麥低聚肽)。

1.2.3 小麥低聚肽對Caco-2細胞活性影響試驗

將處于對數(shù)期的Caco-2細胞消化，流式細胞儀計數(shù)，將細胞濃度稀釋至1×105個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，待細胞融合后，吸除培養(yǎng)液，PBS清洗兩遍，分別用不同濃度的小麥低聚肽的培養(yǎng)液處理細胞，每個濃度設(shè)置6個重復(fù)，同時設(shè)不加低聚肽的空白孔，培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，每孔加入100 μL、0.5 mg/mL MTT，4 h 后，吸除 MTT溶液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩使晶體溶解并混合均勻，490 nm測定各孔的吸光值。

1.2.4 小麥低聚肽對損傷細胞增殖以及細胞死亡率的影響

細胞接種及培養(yǎng)同1.2.3，待細胞融合后，吸除培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，按照1.2.2分組處理細胞，每組設(shè)6個重復(fù)，培養(yǎng)12、24、48 h，吸棄培養(yǎng)液PBS清洗 2 遍，每孔加入100 μL 0.5 mg/mL MTT，4h 后，吸除MTT溶液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩使結(jié)晶物溶解混勻，490 nm測定各孔吸光值。

細胞死亡率的檢測采用乳酸脫氫酶作為檢測指標，細胞接種及處理方法同上，待細胞培養(yǎng)至12、24、48 h吸取各孔上清液測定乳酸脫氫酶(LDH)活性，試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2.5 抗氧化指標測定

細胞接種及處理方法同1.2.4，待細胞培養(yǎng)至12、24、48 h，測定胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、脂質(zhì)過氧化物(MDA)，試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司，實驗方法按照說明書要求操作。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計處理，以x±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05，兩者有顯著性差異;P＜0.01，兩者有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥低聚肽對Caco-2細胞活性影響試驗結(jié)果

由表1可知，各個濃度小麥低聚肽對細胞活性均產(chǎn)生了促進作用，尤以1、5、10 mg/mL小麥低聚肽作用明顯。當小麥低聚肽濃度為0.01 mg/mL時細胞存活率即達到了169.51%，與空白組相比有極顯著性差異(P＜0.01)，在0.01 ～5 mg/mL內(nèi)隨著小麥低聚肽濃度的增大，細胞存活率逐漸增大，并且當小麥低聚肽達到5 mg/mL時細胞存活率達到285.74%，當小麥低聚肽濃度大于5 mg/mL時，隨著小麥低聚肽濃度的增大促進細胞存活率增加的作用逐漸減小，并且當小麥低聚肽達到100 mg/mL時表現(xiàn)出一定的抑制細胞活性的作用，細胞存活率僅為86.19%，與空白組相比存活率顯著降低(P＜0.01)，由此可知，當小麥低聚肽濃度達到一定值后隨著濃度的增加小麥低聚肽對細胞活性表現(xiàn)出抑制作用。

2.2 小麥低聚肽對損傷細胞增殖以及細胞毒性的影響

由表2可知，小麥低聚肽濃度及培養(yǎng)時間均顯著影響Caco-2細胞增殖率。在同一培養(yǎng)時間下，添加小麥低聚肽組、空白組的細胞增殖率與氧化應(yīng)激組相比均有顯著性差異(P＜0.05)，說明 100 μmol/L H2O2對細胞造成顯著的損傷，小麥低聚肽對氧化應(yīng)激損傷的Caco-2細胞仍有顯著的促進增殖的作用，并且呈現(xiàn)隨著小麥低聚肽濃度的增大對損傷細胞增殖率影響越大;不同培養(yǎng)時間之間細胞增殖率的變化出現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間延長各處理組增殖率顯著性增高，尤以5 mg/mL的小麥低聚肽使細胞增殖率升高顯著，增殖率從12 h時的108.99%升高到48 h的138.05%，并且顯著高于空白對照組的112.56%。由以上可知隨著培養(yǎng)時間的延長、小麥低聚肽濃度的提高小麥低聚肽對損傷細胞的增殖率的影響越大，差異越顯著，說明小麥低聚肽對細胞的增殖效應(yīng)與時間濃度正相關(guān)。

由表3可以看出，小麥低聚肽濃度和培養(yǎng)時間對氧化應(yīng)激損傷的Caco-2細胞細胞毒性有顯著的降低。與對照組相比，在培養(yǎng)液中添加1 mg/mL小麥低聚肽，隨著Caco-2細胞培養(yǎng)時間的延長，其細胞毒性即顯著降低。培養(yǎng)至48 h時5、10 mg/mL組的細胞毒性低至8.89%、9.77%，顯著低于氧化應(yīng)激組的20.65%，說明小麥低聚肽對降低H2O2導(dǎo)致的Caco-2細胞毒性損傷有一定的作用。

2.3 小麥低聚肽抗氧化指標測定結(jié)果

由表4、表5可知，空白對照組、添加小麥低聚肽組細胞裂解液中SOD、MDA含量均與氧化應(yīng)激組有差異顯著(P＜0.05)。隨著培養(yǎng)時間的延長，各組細胞內(nèi)SOD活性緩慢增加，尤以5 mg/mL顯著，由12 h時的35.85 U/mg上升到48 h時的54.08 U/mg，2個時間點均明顯高于氧化應(yīng)激組的19.05 U/mg和29.58 U/mg，說明小麥低聚肽通過刺激細胞提高SOD酶的含量從而達到修復(fù)受損細胞的目的;但是，隨著培養(yǎng)時間的延長細胞內(nèi)MDA含量并未明顯減少，可能是一定量的MDA能刺激細胞產(chǎn)生抗氧化作用，從而保護細胞。

3 討論

小麥低聚肽是以小麥谷朊粉為原料，經(jīng)過酶解、分離、過濾、噴霧干燥等工藝制得的小分子多肽物質(zhì)，具有天然無毒、價格低廉等特點，此外，小麥低聚肽中含有大量二肽、三肽等小分子肽類，在攝入后可迅速吸收并發(fā)揮作用，因而是功能食品理想的原料。在眾多生理活性中，其保護腸黏膜的活性近年來研究不多，且目前所進行的小麥低聚肽對腸上皮細胞的研究多是動物實驗［20］，本研究采用Caco-2細胞體外培養(yǎng)的方法，探討小麥低聚肽對Caco-2細胞氧化損傷后修復(fù)的影響，具有簡單、快速、直觀、準確性高等特點。

H2O2是一種常見的強氧化劑，也是氧化應(yīng)激損傷的主要氧化物，正常情況下機體有氧代謝會產(chǎn)生一定量的H2O2，但會迅速被細胞中的抗氧化物酶如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等過氧化物酶清除［21］。當細胞受外界刺激或細胞本身代謝發(fā)生異常時產(chǎn)生的H2O2過量，不能被及時清除時會導(dǎo)致細胞損傷，100 μmol/L的H2O2即可對Caco-2造成嚴重的氧化應(yīng)激損傷［22］。LDH是穩(wěn)定的胞內(nèi)酶，氧化應(yīng)激反應(yīng)會使細胞膜受損，LDH將會通過受損的細胞膜釋放到培養(yǎng)液中，本研究以檢測培養(yǎng)液中LDH的活性差異的方法來判斷細胞毒性的程度;作為自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物以及細胞內(nèi)該反應(yīng)最具代表性的產(chǎn)物，MDA對于觀察胞內(nèi)反應(yīng)以及胞體受損程度具有舉足輕重的作用，機體脂質(zhì)過氧化程度可以由胞內(nèi)MDA含量直接反應(yīng)，因此機體受損程度可以由胞內(nèi)MDA含量間接反應(yīng)［23-24］。作為機體內(nèi)重要的抗氧化酶，SOD能夠清除外源性或者炎癥細胞產(chǎn)生的活性氧，減輕氧化物自由基對細胞質(zhì)膜的毒害。細胞清除氧自由基的能力可以由細胞裂解液中的SOD含量的變化間接反應(yīng)，而機體受自由基攻擊的嚴重程度可以由MDA、LDH含量的變化間接反應(yīng)，因此通過觀察SOD、MDA以及LDH的含量變化可以分析機體受損程度以及修復(fù)能力的強弱［25］。

本實驗應(yīng)用MTT方法檢測不同濃度小麥低聚肽對Caco-2細胞活性的影響，結(jié)果顯示1、5、10 mg/mL小麥低聚肽對Caco-2細胞增殖率影響最為顯著。因此本實驗應(yīng)用100 μnol/L H2O2刺激Caco-2細胞制造氧化應(yīng)激損傷模型，并探討1、5、10 mg/mL對氧化應(yīng)激損傷細胞修復(fù)情況。低濃度(1 mg/mL)小麥低聚肽就能起到抗氧化應(yīng)激的作用，使得細胞毒性、脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA明顯降低，細胞增殖率、抗氧化物酶SOD顯著升高。小麥低聚肽(5 mg/mL)還能夠有效改善H2O2引起的細胞毒性，這種抗細胞毒性也可能是保護損傷細胞的一種表現(xiàn)。隨著小麥低聚肽濃度增大(＞5 mg/mL)并沒有起到更好的抗氧化效果，證明低濃度的小麥低聚肽對體外腸上皮細胞氧化應(yīng)激損傷有顯著的保護作用。

4 結(jié)論

本實驗通過研究小麥低聚肽對Caco-2細胞氧化損傷修復(fù)作用，初步證實了小麥低聚肽具有一定的促進Caco-2細胞增殖和保護損傷腸黏膜的作用。推測小麥低聚肽中的小分子肽類起到促進Caco-2細胞再生以及修復(fù)受損的Caco-2細胞作用，對于腸黏膜疾病的治療以及小麥低聚肽的深度開發(fā)具有重要意義。

［1］ Schmitz H，Barmeyer C，F(xiàn)romm M，et al.Altered tight junction structure contributes to the impaired epithelial barrier function in ulcerative colitis［J］.Gastroenterology，1999，116(2):301-309.

［2］ Weber C R，Turner J R.Inflammatory bowel disease:is it really just another break in the wall?［J］.Gut，2007，56(1):6-8.

［3］ WANG N，YU H L，MA J J，et al.Evidence for tight junction protein disruption in intestinal mucosa of malignant obstructive jaundice patients［J］.Scand J Gastroenterol，2010，45(2):191-199.

［4］ Besselink M G，Santvoort H C，Renooij W，et al.Intestinal barrier dysfunction in a randomized trial of a specific probiotic composition in acute pancreatitis［J］.Ann Surg，2009，250(5):712-719.

［5］ ZHANG R，HU Y，YUAN J，et al.Effects of puerariae radix extract on the increasing intestinal permeability in rat with alcohol-induced liver injury［J］.J Ethnopharmacol，2009，126(2):7-14.

［6］ ZHANG M，DENG C S，ZHENG J J，et al.Curcumin regulated shift from Th1 to Th2 in trinitrobenzene sulphonic acid-induced chronic colitis［J］.Acta Pharmacol Sin，2006，27(8):1 071-1 077.

［7］ CHEN M L，GE Z，F(xiàn)ox J G，et al.Disruption of tight junctions and induction of proinflammatory cytokine responses in colonic epithelial cells by Campylobacter jejuni［J］.Infect Immun，2006，74(12):6 581-6 589.

［8］ Basuroy S，Seth A，Elias B，et al.MAPK interacts with occludin and mediates EGF-induced prevention of tight junction disruption by hydrogen peroxide［J］.Biochem J，2006，393(Pt 1):69-77.

［9］ Audus K L，Bartel R L，Hidalgo I J，et al.The use of cultured epithelial and endothelial cells for drug transport and metabolism studies［J］.Pharm Res，1990，7(5):435-451.

［10］ Hidalgo I J，Raub T J，Borchardt R T.Characterization of the human colon carcinoma cell line(Caco-2)as a model system for intestinal epithelial permeability［J］.Gastroenterology，1989，96(3):736-749.

［11］ Artursson P，Palm K，Luthman K.Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport［J］.Adv Drug Deliv Rev，2001，46(1-3):27-43.

［12］ 劉文穎，林峰，谷瑞增海洋膠原低聚肽的血管舒張和降膽固醇作用［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39(12)，7-11.

［13］ 劉文穎，林峰，金振濤，玉米低聚肽的體外抗氧化作用［J］.食品科學(xué)，2011，32(05)，22-26.

［14］ 楊玉榮，佘銳萍，張日俊.大豆生物活性肽對肉雞腸道黏膜上皮內(nèi)淋巴細胞和IgA+生成細胞的影響［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2006，28(4)，412-414.

［15］ Calzuola I，Giavarini F，Sassi P，et al.Short acidic peptides isolated from wheat sprout chromatin and involved in the control of cell proliferation characterization by infrared spectroscopy and mass spectrometry［J］.Peptides，2005，26(11):2 074-2 085.

［16］ Huebner F R，Lieberman K W，Rubino R P，et al.Demonstration of high opioid-like activity in isolated peptides from wheat gluten hydrolysates［J］.Peptides，1984，5(6):1 139-1 147.

［17］ Shin-ICHI F，Masaaki Y.Opioid peptides derived from wheat gluten:their isolation and characterization［J］.FEBS Letters，1992，296(1):107-111.

［18］ Motoi H，Kodama T.Isolation and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides from wheat gliadin hydrolysate［J］.Nahrung-Food，2003，47(5):354-358.

［19］ JIA Jun-qiang，MA Hai-le，ZHAO Wei-rui，et al.The use of ultrasound for enzymatic preparation of ACE-inhibitory peptides from wheat germ protein［J］.Food Chemistry，2010，119:336-342.

［20］ 潘興昌，印虹，谷瑞增.小麥肽對大鼠氮代謝以及胃腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能的影響［J］.食品科學(xué)，2013，34(5)，264-269.

［21］ Halliwell B，Clement M V，Long L H.Hydrogen peroxide in the human body［J］.FEBS Lett，2000，486(1):10-13

［22］ 杜 威，李雅麗，吳紅照.H2O2對 Caco-2細胞氧化應(yīng)激的影響［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013(9):1 202-1 205.

［23］ 陳 漢，王慧君，李學(xué)峰.甲基苯丙胺對大鼠腦組織中NO、SOD和MDA的影響［J］.中國藥物依賴性雜志，2007，16(2):102-104.

［24］ Pellerin-Massicotte.Oxidative processes as indicators of chemical stress in marine bivalves［J］.Aquat Ecosyst Health，1994，3(2):101-111.

［25］ 崔志文，黃琴 ，黃怡.枯草芽孢桿菌對Caco-2細胞抗氧化功能的影響研究［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報，2011，23(2):293-298.