王梓任 陸天琳 徐 曼 楊麗群

(西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶 400716)

家蠶免疫血清體外抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞生長和增殖*

王梓任 陸天琳 徐 曼 楊麗群

(西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶 400716)

家蠶免疫系統(tǒng)在抵抗病原微生物時會產生一些具有免疫功能的小分子肽，有研究表明這些肽具有抗腫瘤活性。我們通過免疫誘導法，給家蠶注射了一定量的抗原誘導家蠶產生免疫血清。從家蠶體內收集免疫血清，稀釋成不同濃度梯度處理神經(jīng)母細胞瘤細胞系BE(2)C，并觀察其對BE(2)C細胞的影響。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)免疫血清處理后腫瘤細胞出現(xiàn)了大面積死亡。經(jīng)MTT方法檢測分析后發(fā)現(xiàn)，家蠶免疫血清對腫瘤細胞生長有抑制作用。實驗結果初步證實了經(jīng)抗原誘導的家蠶免疫血清對神經(jīng)母細胞瘤系BE(2)C的生長及增殖有抑制作用，推測家蠶免疫血清可能誘導了腫瘤細胞發(fā)生凋亡，為進一步解析其調控機制提供了有力的數(shù)據(jù)支撐，為開發(fā)家蠶新的經(jīng)濟用途奠定了良好基礎。

家蠶；血清；神經(jīng)母細胞瘤；細胞增殖

家蠶是鱗翅目昆蟲的代表，在我國擁有悠久的飼養(yǎng)歷史，同時家蠶作為一種新興的模式生物，已經(jīng)完成了家蠶全基因組圖譜的測定。家蠶免疫系統(tǒng)在受到刺激時可以合成抗菌肽[1]，抗菌肽除了擁有廣譜抗菌活性外還具有抗腫瘤活性[2]?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的抗菌肽主要有天蠶素、雙翅肽、攻擊素、抗真菌肽和防衛(wèi)素等 。現(xiàn)在的研究對家蠶抗菌肽抗腫瘤機理尚未解析清楚[3]，一般認為抗菌肽在水溶液中沒有穩(wěn)定構象，只有在接近細胞膜后才形成高級構象，并聚合形成離子通道，破壞細胞膜使細胞死亡[4]?？咕膶δ[瘤細胞有選擇性殺傷，主要原因可能是正常細胞表面的膽固醇可以阻止抗菌肽形成高級構象，而癌細胞表面缺乏膽固醇[5]，抗菌肽可以形成高級構象并進一步聚合成離子通道破壞細胞。Christense等[7]人用脂質體模型描述了抗菌肽作用于膜的過程。抗菌肽首先通過靜電作用被吸引到膜表面，然后疏水性尾巴插入細胞膜中的疏水區(qū)域，改變膜的構象，最后多個抗菌肽聚合在膜上形成離子通道，破壞細胞膜的結構。

神經(jīng)母細胞瘤，是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤[6]，約占所有顱內原發(fā)腫瘤的一半，多出現(xiàn)在幼兒時期，誘發(fā)原因復雜[8]。存在惡性程度高，預后效果差[9]，容易復發(fā)[10]，治療手段缺乏[11]等問題。神經(jīng)母細胞瘤系BE(2)C細胞是已經(jīng)被鑒定的，具有腫瘤干細胞特性的細胞系[7]，具有重要的研究價值和研究意義。目前尚無關于家蠶免疫血清對神經(jīng)母細胞瘤作用的研究報道。本研究基于家蠶免疫學，通過給家蠶分別注射大腸桿菌或LPS，誘導家蠶產生免疫血清，用免疫血清處理BE(2)C細胞，然后通過細胞形態(tài)學觀察和MTT法驗證家蠶免疫血清對BE(2)C細胞的抑制作用，為近一步研究其抗腫瘤分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑

家蠶品系大造P50由西南大學家蠶基因資源庫保存。大腸桿菌DH52、神經(jīng)母細胞瘤BE(2)C細胞由本實驗室保存。細菌內毒素LPS、F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、PEN青霉素抗生素、MTT液等均購自Invitrogen公司。

1.2 家蠶免疫血清獲取

(1)大腸桿菌誘導家蠶免疫血清的獲得。取大腸桿菌菌液1 200r/min離心10min后棄上清，用1×PBS清洗3次，結晶紫染色并計數(shù)。取5齡3d的大造家蠶，暫停喂食5～6h后，用輸液注射器每只注射2 000個大腸桿菌。注射后正常喂食桑葉。免疫誘導24h、48h后給收集血淋巴。血淋巴在3 000r/min離心5min去除血細胞，獲得家蠶血清。取出的血清立即加入苯基硫脲防止血清氧化。用0.22μm孔徑的濾膜過濾血清，分裝后放入-20℃冰箱冷凍保存。

(2)LPS誘導家蠶免疫血清的獲得。取出-20℃冷藏的LPS用1×PBS緩沖液稀釋備用，根據(jù)一般LPS刺激細胞時所用的濃度，取5齡3d大造家蠶每頭注射100ng，注射后正常喂食桑葉。注射24h、48h后收集血清，方法同上。

(3)對照組家蠶血清的獲得。取5齡3d的大造家蠶，暫停喂食5～6h后，用輸液注射器每只注射5μL的1×PBS，注射后正常喂食桑葉。注射24h、48h后收集血清，方法同上。

1.3 顯微鏡觀察比較家蠶免疫血清對腫瘤的作用

在直徑100mm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)BE(2)C細胞，直到細胞增殖至對數(shù)生長期。吸出培養(yǎng)基，用1×PBS反復清洗3遍，加入8ml分別含有10%通過不同方法免疫后產生的家蠶免疫血清的DMEM12培養(yǎng)基。對照組每盤加入8ml注射PBS后取得的家蠶血清用同樣方法配置成終濃度10%的培養(yǎng)液。正常培養(yǎng)12h后顯微鏡觀察腫瘤細胞形態(tài)變化及生長情況。

1.4 MTT法檢測家蠶免疫血清對腫瘤增殖的抑制

將貼壁生長并處于對數(shù)生長期的BE(2)C細胞用胰蛋白酶消化，800r/min離心5min，棄上清，用DMEF12培養(yǎng)基重懸，加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1 000個細胞，于37℃、5% CO2孵箱中過夜培養(yǎng)。次日，吸出每孔中的培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次。實驗組Ⅰ將大腸桿菌誘導的家蠶免疫血清用DMEF12完全培養(yǎng)基按梯度配置成家蠶血清終濃度為2%、5%和10%的培養(yǎng)液，每種濃度重復5孔，每孔加入100μL處理。實驗組Ⅱ將LPS誘導的家蠶免疫血清用同樣方法稀釋成終濃度為2%、5%和10%的培養(yǎng)液，每種濃度重復5孔，每孔加100μL處理。對照組將注射PBS后取得的家蠶血清用同樣方法配置成家蠶血清終濃度為2%、5%和10%的培養(yǎng)基，每種濃度重復5孔，每孔加入100μL處理。同時設置調零孔 (加入200μL完全培養(yǎng)基, 不含細胞 )。家蠶血清與腫瘤細胞作用12h后每孔加20μL MTT溶液終止，于37℃溫箱溫育4h，取出置于常溫水平搖床搖30min，之后于560nm處檢測其吸光值。采用GraphPad Prism進行統(tǒng)計分析，并進行方差分析，繪制柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 血清處理BE(2)C細胞后顯微鏡觀察

在對用不同家蠶血清處理后腫瘤細胞的顯微鏡觀察。對照組用正常家蠶血清分別處理24h，48h，在顯微鏡下可以觀察到對照組(48h未展示)BE(2)C細胞形態(tài)正常，邊界明顯，生長狀況良好。實驗組分別使用大腸桿菌誘導家蠶免疫血清和LPS誘導家蠶免疫血清處理腫瘤細胞24h和48h。顯微鏡觀察顯示(48h圖片未展示)的BE(2)C細胞結構塌陷，邊界模糊，生長狀況不好，同時在觀察時還發(fā)現(xiàn)有大量細胞處于懸浮狀態(tài)，有可能是因為家蠶免疫血清誘導腫瘤細胞凋亡所致。另外，LPS誘導免疫血清處理后BE(2)C細胞數(shù)量明顯少于大腸桿菌誘導免疫血清處理后的BE(2)C細胞，觀察結果提示LPS誘導免疫血清抗腫瘤活性可能優(yōu)于大腸桿菌誘導免疫血清。

顯微鏡觀察的結果顯示LPS誘導的家蠶免疫血清和大腸桿菌誘導的家蠶免疫血清對腫瘤細胞BE(2)C都有殺傷作用，且LPS誘導的免疫血清抑瘤效果可能優(yōu)于大腸桿菌誘導的免疫血清，但需要進一步實驗證明。

圖1 不同家蠶血清處理BE(2)C細胞后顯微鏡觀察

2.2 MTT法檢測家蠶免疫血清對BE(2)C細胞的抑制效率

根據(jù)顯微鏡下細胞形態(tài)學觀察的結果，進一步進行MTT實驗，檢測家蠶免疫血清對腫瘤細胞生長的作用效果。結果顯示(48h誘導免疫血清數(shù)據(jù)未展示)與對照組相比，大腸桿菌免疫血清組從濃度為2%處開始就產生了對神經(jīng)母細胞瘤細胞系BE(2)C細胞增殖的抑制作用。當血清濃度升高后，正常血清對腫瘤細胞仍然沒有作用，免疫血清組的BE(2)C細胞增殖仍受到抑制。

用濃度梯度為2%、5%和10%的LPS誘導家蠶免疫血清處理BE(2)C細胞，在低濃度2%處即出現(xiàn)對腫瘤細胞增殖的抑制，并且隨著免疫血清濃度的提高，其對BE(2)C細胞增殖的抑制作用越發(fā)顯著。與對照組相比，血清濃度在10%時對BE(2)C細胞生長抑制效果極顯著。

MTT實驗說明，通過不同免疫方法得到的血清都可以抑制BE(2)C細胞增殖，且大腸桿菌免疫血清對BE(2)C細胞的抑制不具有濃度依賴性，但是LPS免疫血清對BE(2)C細胞的抑制隨著免疫血清濃度的增加而效果變得更為顯著。在10%濃度的情況下LPS誘導的免疫血清抑制效果極顯著，而大腸桿菌誘導的免疫血清抑制效果為顯著，所以總體來看LPS誘導的家蠶免疫血清對腫瘤增殖的抑制效果優(yōu)于大腸桿菌誘導的免疫血清。

圖2 不同免疫血清對BE(2)C細胞增殖的抑制作用

3 討論

神經(jīng)母細胞瘤是發(fā)生于神經(jīng)外胚葉組織的腫瘤，占所有顱內腫瘤的40%～50%[12]。具有高發(fā)病率、高復發(fā)率、高病死率和低治愈率“三高一低”的特點，所以尋求一種安全有效的抗神經(jīng)母細胞瘤藥物成為當務之急。本實驗采用免疫誘導的方法誘導家蠶產生免疫血清，根據(jù)已有報道，經(jīng)免疫誘導后的家蠶血清含有抗菌肽，且抗菌肽對腫瘤有抑制效果[13-15]。本實驗是利用家蠶免疫系統(tǒng)的特性，注射對家蠶本身無害，但同時具有高免疫原性的物質大腸桿菌及LPS，刺激家蠶發(fā)生免疫應答，從而獲得家蠶免疫血清。分別使用一定濃度的家蠶免疫血清和正常家蠶血清處理神經(jīng)母細胞瘤細胞系BE(2)C，12h后發(fā)現(xiàn)家蠶免疫血清可以抑制BE(2)C細胞生長，而正常家蠶血清對細胞生長無明顯影響。MTT法進一步驗證，經(jīng)大腸桿菌及LPS免疫誘導的家蠶血清對BE(2)C細胞生長都有明顯抑制作用， 且LPS誘導的家蠶免疫血清對BE(2)C的抑制作用隨免疫血清濃度升高而變強，終濃度為10%的LPS免疫誘導的家蠶血清對BE(2)C增殖能力抑制最為顯著。本文驗證了家蠶免疫血清可以抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞系BE(2)C的生長及增殖。目前研究報道的誘導家蠶產生抗菌肽的方法主要是用沾有細菌的針刺傷家蠶，這種方法比較粗獷，無法控制每次進入家蠶體內細菌的數(shù)量，可重復性低。本實驗采用的方法是將抗原物質溶解于PBS中，從體壁注射到家蠶體內，這樣每次試驗注入家蠶的抗原量一定，實驗具有較好的可重復性。

另外，經(jīng)家蠶免疫血清處理后的BE(2)C細胞生長受到抑制的同時，還出現(xiàn)了細胞皺縮，邊界模糊，貼壁能力下降等現(xiàn)象。但是家蠶免疫血清是否能夠誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡的，還有待進一步的研究。

本文驗證了經(jīng)抗原誘導的家蠶免疫血清對神經(jīng)母細胞瘤系BE(2)C的生長及增殖有抑制作用，推測家蠶免疫血清可能誘導了腫瘤細胞發(fā)生凋亡，為進一步解析其調控機制提供了有力的數(shù)據(jù)支撐，為開發(fā)家蠶新的經(jīng)濟用途奠定了良好基礎。

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Silkworm immune serum inhibits the growth and proliferation of neuroblastoma cell in vitro

WANG Zi-ren，LU Tian-lin，XU Man，YANG Li-qun

(StateKeyLaboratoryofSilkwormGenomeBiology，SouthwestUniversity，Chongqing400716，China)

Silkworm immune system produce some immuno-competent micromolecule peptide when they are resisted by microbial pathogens. Recently researches indicated that those micromolecule peptide had antibiotic and antitumor activities.. We inject a certain amount of antigen to induce silkworms produce immune serum. We collect the immune serum from the injected silkworm, and dilute it into different concentration gradient to treat neuroblastoma cell line BE(2)C, and observe the effect of the serum on BE(2)C cells. By microscopic observation, we found that there is a large amount of cells dead after the treatment of immune serum. Detected by MTT analysis, the silkworm immune serum has inhibitory effect on tumor cell growth. The experimental results confirmed that the antigen induced silkworm immune serum inhibited the growth and proliferation of neuroblastoma cell line BE(2)C, speculated that the silkworm immune serum could induce apoptosis of tumor cells, provides a powerful data support for further analysis of the regulation mechanism, which lay a good foundation in developing a new economic purposes of silkworm.

Bombyxmori；Serum；Neuroblastoma；Cell proliferation

*資助項目：國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃(No.201410635047)，國家自然科學基金(No.81201551),西南大學基本科研業(yè)務費(No.XDJK2013B020)。

王梓任(1993-)，男，本科生。E-mail：wzrforsci@sina.com陸天琳，(1993-)，女，本科生。E-mail：applelt11993@gmail.com

楊麗群，教授，博士生導師。E-mail:cysylq@swu.edu.cn