房守敏

(西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南充 637002)

家蠶熱激蛋白HSP90的鑒定、進(jìn)化與表達(dá)模式*

房守敏

(西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南充 637002)

熱激蛋白90是一類廣泛分布與各類生物體中、高度保守的分子伴侶。HSP90s具有幫助受損蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊，防止聚集并恢復(fù)其正常構(gòu)象等功能。昆蟲HSP90s與生長(zhǎng)發(fā)育、滯育和殺蟲劑抗性等均相關(guān)。本研究在全基因組水平對(duì)家蠶HSP90s進(jìn)行了鑒定，共分析獲得3個(gè)基因(BGIBMGA004612、BGIBMGA012753和BGIBMGA001241)。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生分析，對(duì)家蠶HSP90s分別命名為BmHSP90A1、BmHSP90B1和BmTrap1，它們分屬于3個(gè)亞家族。家蠶與黑腹果蠅HSP90s直系同源基因的蛋白序列一致性均在60%以上。與其他物種HSP90s一樣，家蠶HSP90s含有N-端ATPase結(jié)構(gòu)域，4個(gè)特征性序列。基于組織和發(fā)育時(shí)期芯片及表達(dá)序列標(biāo)簽，發(fā)現(xiàn)家蠶HSP90s基因均有表達(dá)?；谛酒瑪?shù)據(jù)，BmHSP90A1在雌雄間具有非常相似的表達(dá)模式，而BmTrap1在5齡幼蟲精巢中的信號(hào)值高達(dá)16 082.5，暗示著該基因可能與精巢發(fā)育相關(guān)。HSP90s作為一類功能廣泛的分子伴侶，本研究將為其功能研究奠定基礎(chǔ)。

家蠶；熱激蛋白90；表達(dá)模式；序列分析；結(jié)構(gòu)域

熱激蛋白(又稱熱休克蛋白，Heat shock proteins，HSPs)是應(yīng)激后細(xì)胞內(nèi)優(yōu)先合成的一組蛋白質(zhì)，在正常狀態(tài)下的細(xì)胞中也廣泛存在，參與調(diào)控、維持細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的構(gòu)象和功能[1-2]。熱激蛋白是生物體耐受冷熱應(yīng)激的重要抗逆蛋白之一，生物體在應(yīng)激過程中，熱激蛋白能確保新合成的蛋白正確折疊，以及幫助變性蛋白的重折疊[3]。按照分子量大小可以分為不同的家族：15～30kDa之間的小熱激蛋白small HSPs、HSP60s、HSP70s、HSP90s和HSP110s五大類[4-7]。HSP90在正?；蛎{迫條件下的各類細(xì)胞胞質(zhì)中都有存在，作為陪伴蛋白與變性蛋白結(jié)合，維持它們的折疊狀態(tài)。HSP90能與類固醇激素受體、酪氨酸激酶、絲氨酸-酪氨酸激酶等信號(hào)傳導(dǎo)蛋白相互作用并形成復(fù)合體，使其具有生物活性[8-10]。在人體內(nèi)，HSP90與多種癌癥，如白血病(leukemia)、全身紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosus)及多藥耐藥性相關(guān)[11]。

HSP90s在分子進(jìn)化中高度保守，根據(jù)物種和細(xì)胞器的分布特征，該家族可以分為5個(gè)亞家族HSP90A、HSP90B、HSP90C、TRAP(tumor necrosis factor receptor-associated protein)和HTPG(high temperature protein G)[3]。研究表明，HTPG僅分布于真細(xì)菌(Eubacterial)，HSP90C則是特異分布于植物葉綠體的類型。而HSP90A、HSP90B和TRAP則是指分布位于胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的HSP90s。相對(duì)而言，HSP90A、HSP90B的分布較廣，在原生生物、植物、真菌和動(dòng)物中均有發(fā)現(xiàn)[3]。通常，胞質(zhì)型HSP90A的C-端含有保守的特征性MEEVD基序[12]。大多數(shù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型HSP90B的C-端則含有KDEL四個(gè)氨基酸特征基序，其作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)，但并不是所有的HSP90B均含有此保守的基序[3]。

家蠶(Bombyxmori)是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，隨著季節(jié)的改變，家蠶的生長(zhǎng)和發(fā)育也將遭受溫度變化的考驗(yàn)。HSP90s作為重要的環(huán)境適應(yīng)性蛋白，其誘導(dǎo)表達(dá)可能幫助家蠶幼蟲適應(yīng)劇烈的環(huán)境溫度變化及盡量克服其對(duì)家蠶帶來的傷害[13]。然而，HSP90s作為重要的一類蛋白，其受溫度和其他誘導(dǎo)因子的表達(dá)反應(yīng)及其功能并未有報(bào)道。本研究主要對(duì)家蠶基因組中可能的HSP90s基因進(jìn)行鑒定，并與其他昆蟲的HSP90s比較分析，利用已有的芯片和表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tags，ESTs)數(shù)據(jù)分析其表達(dá)模式，旨在為后續(xù)對(duì)HSP90s基因的功能分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 HSP90基因的鑒定

在Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)下載HSP90s保守域蛋白序列PF00183.14，利用HMMER 3.0 軟件(HMMER 3.0，http://hmmer.janelia.org/)在家蠶基因組預(yù)測(cè)的蛋白數(shù)據(jù)庫(Silkdb， http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/)搜索潛在的HSP90s序列。并利用在線工具Pfam和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析上述候選基因是否含有HSP90s保守域。

GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中下載黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)和蜜蜂(Apismellifera)[3]的HSP90s蛋白序列，與家蠶基因組序列作tBlastn同源性檢索。提取含有候選基因的scaffold區(qū)段，利用FGENESH/FGENESH+(http://linux1.softberry.com/)軟件預(yù)測(cè)基因的編碼區(qū)(coding sequence，CDS)和推導(dǎo)的氨基酸序列。同樣以Pfam和SMART在線工具分析預(yù)測(cè)的基因是否含有HSP90s保守域。我們對(duì)HSP90s編碼的蛋白分子量MW/等電點(diǎn)pI在http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html工具網(wǎng)站進(jìn)行了預(yù)測(cè)。

為了比較家蠶與其他鱗翅目昆蟲HSP90s基因進(jìn)化的關(guān)系，我們?cè)跀?shù)據(jù)庫http://www.heliconius.org/和http://monarchbase.umassmed.edu/分別下載了詩神袖蝶(Heliconiusmelpomene)和帝王蝶(Danausplexippus)的基因組和預(yù)測(cè)的基因數(shù)據(jù)，利用家蠶HSP90s的鑒定方法，對(duì)2種蝴蝶的HSP90s進(jìn)行了相似的分析。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用Clusta lx1.8 軟件對(duì)黑腹果蠅、蜜蜂及本研究鑒定家蠶、詩神袖蝶和帝王蝶HSP90s蛋白序列進(jìn)行了多序列比對(duì)。采用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA6.0[14]構(gòu)建HSP90s的鄰近系統(tǒng)發(fā)生樹(neighbor-joining phylogentic tree)，選用Jones-Taylor-Thornton(JTT)模型，序列中的缺失采用成對(duì)刪除(pair deletion)的方式計(jì)算兩兩序列間的遺傳距離。另外，拓?fù)錁涓鞣种Ч?jié)點(diǎn)均進(jìn)行重抽樣檢驗(yàn)( Bootstrap估算，重復(fù)1 000次)，檢驗(yàn)分子系統(tǒng)樹各處的置信度。

2 結(jié)果與討論

2.1 家蠶HSP90s的鑒定與進(jìn)化分析

Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)下載HSP90s隱馬爾可科夫模型，利用HMMER搜索家蠶基因組預(yù)測(cè)的蛋白數(shù)據(jù)庫，并通過保守域的分析，共鑒定出BGIBMGA004612、BGIBMGA012753和BGIBMGA001241三個(gè)基因?；谠缙趯?duì)黑腹果蠅和蜜蜂HSP90s的鑒定[3]，我們?cè)贕enBank中下載黑腹果蠅和蜜蜂的HSP90s蛋白序列，并與家蠶基因組tBlastn比對(duì)搜索，提取與HSP90s同源的scaffold進(jìn)行基因預(yù)測(cè)。Blast搜索與HMMER方法獲得了一致的HSP90s基因序列。因此，家蠶基因組中共鑒定出3個(gè)HSP90s基因。利用相同的分析方法，獲得了詩神袖蝶(HMEL006062、HMEL006610和HMEL017770)和帝王蝶(DPOGS213899、DPOGS206511和DPOGS211870)的HSP90s。

我們將鑒定的家蠶、詩神袖蝶和帝王蝶及已知的黑腹果蠅和蜜蜂HSP90s蛋白序列構(gòu)建了鄰近系統(tǒng)發(fā)生樹(圖1)。結(jié)果表明，這些昆蟲HSP90s共聚為3簇，分別是HSP90A、HSP90B和TRAP，這些物種間的HSP90s表現(xiàn)出較明顯的直系同源關(guān)系，表明這些熱激蛋白在物種分化前已經(jīng)產(chǎn)生，在物種形成后可能由于功能約束等原因保存著較低的進(jìn)化速率。除蜜蜂HSP90A在物種內(nèi)發(fā)生了一次基因擴(kuò)增外，其他幾個(gè)物種的HSP90s基因均只有3個(gè)基因。

圖1 家蠶和其他昆蟲HSP90的鄰近系統(tǒng)發(fā)生樹

基于MEGA 6.0構(gòu)建的鄰近(Neighbor-Joining，NJ)樹，選取的重要參數(shù)為：JTT模型、成對(duì)刪除gaps及1 000重復(fù)；節(jié)點(diǎn)處僅顯示了>50%的Bootstrap值；HSP90蛋白前面的Dp為帝王蝶(Danausplexippus)的簡(jiǎn)寫；Hm為詩神袖蝶(Heliconiusmelpomene)，Bm為家蠶(Bombyxmori)；Dm為黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)；Am蜜蜂(Apismellifera)。

2.2 HSP90s的保守結(jié)構(gòu)域

HSP90s是一類高度保守、受ATP調(diào)節(jié)的二聚體分子伴侶。我們對(duì)家蠶與黑腹果蠅HSP90s序列相似性進(jìn)行了計(jì)算(表1)。BmHSP90A1與DmHSP90A1的序列一致性高達(dá)84.5%，BmHSP90B1與DmHSP90B1為62.6%，BmTrap1與DmTrap1為62.8%。即使不同亞家族成員間的序列一致性也在30%以上。

HSP90s最重要的功能即是在ATP協(xié)助下幫助受損蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊，防止聚集并恢復(fù)其正常構(gòu)象。HSP90s的N-端含有高度保守的ATPase結(jié)構(gòu)域，是ATP /ADP結(jié)合位點(diǎn)，具有內(nèi)源ATPase活性[15]。家蠶3個(gè)HSP90s蛋白在SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)N-端均含有ATPase結(jié)構(gòu)域(圖2)。另外，BmHSP90A的C-端含有保守的特征性MEEVD基序，是定位于胞質(zhì)的特征序列。而KDEL四個(gè)氨基酸特征基序作為蛋白定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)，但BmHSP90B的C-端為RDEL，黑腹果蠅為HDEL。因此，HSP90B的C-端定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特征基序發(fā)生了一定的分化。

表1 家蠶與黑腹果蠅HSP90s氨基酸序列一致性(%)矩陣

“▼”表示功能重要的殘基。下劃線對(duì)應(yīng)組氨酸激酶樣ATP酶區(qū)域?！?”標(biāo)注的是特征性序列[3]。

HSP90s作為高度保守的基因，其編碼蛋白除N-端的ATPase結(jié)構(gòu)域外，還含有4個(gè)特征性序列(圖2)。我們對(duì)圖1中所有的HSP90s蛋白序列進(jìn)行了特征性序列保守性分析(圖3)。結(jié)果表明，特征性序列Signature I和III更為保守，在不同的亞家族間具有基本一致的序列。Signature II和IV在不同亞家族間部分位點(diǎn)發(fā)生了較大的分化，但其中功能重要的殘基仍然保守(圖2、圖3)。

基于圖1系統(tǒng)發(fā)生樹中所有的序列進(jìn)行特征性序列分析，logo圖在http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi繪制。

2.3 家蠶HSP90s的表達(dá)模式

基于家蠶5齡3d各組織及發(fā)育時(shí)期的基因芯片數(shù)據(jù)[16]，我們對(duì)家蠶的HSP90s基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。我們將HSP90s的CDS序列與家蠶芯片探針數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastn比對(duì)，三個(gè)基因均找到了對(duì)應(yīng)的探針序列，組織與發(fā)育時(shí)期芯片數(shù)據(jù)的表達(dá)模式如圖4。BmHSP90B1基因在已有的芯片數(shù)據(jù)中未探測(cè)到其表達(dá)(信號(hào)值<400)，但將其CDS與GenBank中家蠶表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tags，ESTs)作Blastn搜索時(shí)，發(fā)現(xiàn)了大量來源不同組織的ESTs，因此，BmHSP90B1也是一個(gè)具有活性的熱激蛋白。BmHSP90A1和BmTrap1基因在各發(fā)育時(shí)期和及5齡3d組織中均有表達(dá)信號(hào)(圖4)，它們?cè)谡Ｉ項(xiàng)l件下也具有高水平表達(dá)，表明它們兼有持家基因的功能，而對(duì)細(xì)胞中的蛋白正確折疊等起保護(hù)的作用。BmHSP90A1在雌雄間具有非常相似的表達(dá)模式，而BmTrap1在5齡幼蟲精巢中的信號(hào)值為16 082.5，而在雌性卵巢中的表達(dá)信號(hào)僅為2 647.83。BmTrap1在精巢呈現(xiàn)如此高的表達(dá)，是否與精巢發(fā)育、精子發(fā)生等相關(guān)有待進(jìn)一步研究。

芯片數(shù)據(jù)下載自Silkdb。A)發(fā)育時(shí)期芯片數(shù)據(jù)；B)5齡3天幼蟲各組織中的表達(dá)。表達(dá)信號(hào)值≥ 400即視為有表達(dá)[16]。

盡管昆蟲HSP90s的生理功能研究起步較晚，但目前已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展[17]。一方面，昆蟲的熱激蛋白基因可能在昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育、滯育期間、種群密度等方面起著一定的作用[17]。另一方面，昆蟲HSP90s可能作用于維持蛋白的結(jié)構(gòu)或活化蛻皮激素，與滯育是密切關(guān)聯(lián)。另外，HSP90s蛋白可能與昆蟲殺蟲劑抗性相關(guān)，可能防止蛋白降解、抑制細(xì)胞膜中脂類的過氧化等。因此，HSP90s是保護(hù)細(xì)胞維持正常功能的重要蛋白之一，隨著深入研究昆蟲HSP90s在逆境條件下的功能，對(duì)農(nóng)林害蟲防治有著重要的指導(dǎo)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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Identification, evolution and expression patterns of HSP90 in the silkworm

FANG Shou-Min

(CollegeofLifeScience,ChinaWestNormalUniversity,Nanchong637002)

Heat shock protein 90 is a kind of highly conserved molecular chaperones which are widely distributed in a variety of organisms. HSP90s help the damaged proteins to transport, fold and prevent aggregation. Insects HSP90s are associated with growth and development, diapause and insecticide resistance, etc. In this study, HSP90s were identified in the whole genome of the silkworm. Three genes (BGIBMGA004612,BGIBMGA012753 andBGIBMGA001241) were characterized. Based on the phylogenetic analysis, the three silkworm HSP90s were namedBmHSP90A1,BmHSP90B1 andBmTrap1, which belong to three subfamilies. The orthologous HSP90s of silkworm andDrosophilamelanogastershared more than 60 percent of amino acid sequence identity. Silkworm HSP90s also contain N-terminal ATPase domain and four signature sequences. Based on tissue and developmental microarray and expression sequence tags, we found all silkworm HSP90s genes were expressed. In the microarray data,BmHSP90A1 showed similar expression pattern between male and female. Expression signal ofBmTrap1 reached to 16082.5, which suggested that it might be related to development of testis. HSP90s family is one kind of chaperone with wide range of functions, this research will provide the foundation for functional studies.

Bombyxmori; Heat shock protein 90; Expression pattern; Sequence analysis; Domain

*資助項(xiàng)目：西華師范大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(13D001)。