曹 奕 吳洪喜 陳愛華① 吳楊平 張 雨王 超 張志偉 姚國興 蔡永祥

(1.江蘇省海洋水產研究所 江蘇省海洋經濟貝類研究開發(fā)中心 南通 226007;2.浙江省海洋水產養(yǎng)殖研究所 浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護重點實驗室 溫州 325005)

大竹蟶(Solen grandis)隸屬瓣鰓綱、竹蟶科、竹蟶屬,在渤海遼東灣與萊州灣、南海北部灣、黃海朝鮮灣、海州灣及南部海域均有分布。其個體較大,肉質鮮美,是我國重要的經濟貝類。近年來,因大竹蟶市場需求擴大導致的過度采捕,以及海洋生態(tài)環(huán)境的惡化,造成了大竹蟶野生資源量的急劇減少,故需通過人工增養(yǎng)殖等手段來對大竹蟶資源進行保護。近十幾年以來,江蘇、山東等地均開展了對于大竹蟶人工繁育技術的研究(侯和要等,2004;陳愛華等,2009),并進行了規(guī)模不等的增殖放流活動;其中,江蘇省海洋水產研究所以江蘇啟東大竹蟶群體為親本育成幼苗放流至江蘇蔣家沙海域的規(guī)模為最大,自 2007年來,共計放流4.5mm左右的苗種6.26×108ind,江蘇大竹蟶資源量上升明顯。然而,人工繁育群體的瓶頸效應和近交衰退現(xiàn)象較野生群體更為明顯,在一定程度上會導致群體遺傳多樣性的改變。而遺傳多樣性水平與生長速度、抗病能力等生產性狀密切相關(李俊清等,2006)。因此,對大竹蟶野生群體和增殖放流群體遺傳多樣性水平進行鑒定,一方面能夠確保我國種質資源的可持續(xù)利用,另一方面能為后續(xù)的良種選育研究提供理論數據。

ISSR作為一種共顯性、重復性好、穩(wěn)定性高、價格低廉的分子標記,已被廣泛運用在貝類遺傳學研究中。目前國內對大竹蟶群體的研究主要采用SSR和AFLP等方法(喬洪金等,2012;張?zhí)系?2013),本文通過該技術對我國沿海大竹蟶群體進行遺傳多樣性研究,評判增殖放流活動對野生群體遺傳結構的影響,能夠了解大竹蟶當前的種質資源狀況,為合理保護該資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2013年11月至2014年3月,通過實地采樣獲得廣西北海、江蘇啟東、山東日照、遼寧營口、河北秦皇島、江蘇蔣家沙增殖放流區(qū)等處大竹蟶(采樣信息見表1)。每個群體選取25個規(guī)格較為一致的健康個體,取其斧足,用于實驗。

表1 大竹蟶樣品采集時間及經緯度Tab.1 Sampling time,longitudes and latitudes of the S.grandis population

1.2 DNA提取

采用傳統(tǒng)的酚-氯仿法進行提取。紫外分光光度計OD-1000測定樣品DNA的濃度和純度,并進行電泳驗證,提取所得的DNA保存在–20°C環(huán)境下。

1.3 引物合成及篩選

由上海生工生物工程有限公司合成60條ISSR引物用于篩選,其序列均來自哥倫比亞大學(UBC)。PCR 反應體系含 50ng/μL 模板 DNA 1.0μL,10×PCR buffer (含 Mg2+)2.5μL,10mmol/L dNTP 1.0μL,10μmol/L引物 1μL,5U/μL Taq 酶 0.2μL,加 ddH2O 至 25μL;反應條件如下: 反應前94°C預變性4min,94°C變性45s,38—55°C 退火 45s,72°C 延伸 60s,共 35個循環(huán),反應后72°C延伸7min。

1.4 ISSR-PCR

篩選得出10條結果較佳的引物對大竹蟶6個群體共 150個樣品進行 ISSR-PCR擴增,產物進行2%瓊脂糖電泳(120V,100mA,90min),EB染色后用Bio-Rad Doc XR凝膠成像系統(tǒng)拍照。對所得電泳圖進行分析。電泳結果如圖1所示。

圖1 UBC 824引物對BH群體的擴增結果Fig.1 The result of ISSR-PCR of primer UBC 824 to BH population

1.5 數據分析

獲得ISSR電泳圖譜后,用Quantity One軟件進行分析,將所得結果進行歸類。采用Popgene32軟件進行遺傳參數分析,并根據各群體遺傳多樣性參數計算了群體內基因多樣性(Hs)、群體總基因多樣性(Ht)、各群體間的遺傳分化指數(Gst)(Gst=1–Hs/Ht)(Slatkin et al,1989)、遺傳距離(D)(Nei,1978)?；谶z傳距離,用Mega5.0軟件構建6個群體及150個樣品的 UPGMA聚類樹。利用 Arlequin 3.5軟件(Excoffier et al,2010)對所有群體間和群體內的遺傳變異進行分子變異分析(AMOVA),計算群體間遺傳分化系數(Φst)。

2 結果與分析

2.1 大竹蟶群體內的遺傳分析

篩選得出的10條引物序列見表2,從所有6個群體中共擴增得到清晰位點 127個,其中多態(tài)性位點118個(PPB=92.91%)。5個野生群體的H值和I值分別在0.0982—0.1633和0.1603—0.2776之間(見表3),江蘇蔣家沙增殖放流各項遺傳多樣性參數均低于親本QD野生群體。

2.2 大竹蟶群體間的遺傳分化

野生群體間 Gst=0.1065,增殖放流群體(JJ)與其親本 QD群體的Gst=0.0235,所有群體的遺傳分化系數 Gst=0.1370(見表 4)。野生群體兩兩間 Gst在0.0525—0.0857間,其中 BH群體與其余野生群體間Gst均在0.07以上(見表6)。

表2 篩選獲得引物序列Tab.2 The nucleotide sequences of selected primer

而從AMOVA分析結果可以看出,Φst=0.1268,即在總變異中,12.68%的變異歸因于大竹蟶群體間的變異,87.32%的變異歸因于群體內的變異,群體間和群體內變異均顯著(P＜0.01)(見表5),該結果與分析所得的Gst值基本一致。

2.3 遺傳距離與聚類分析

利用 Popgene32軟件計算了大竹蟶各群體間的Nei’s遺傳距離(見表6)。5個大竹蟶野生群體間遺傳距離值變化范圍為 0.0139—0.0387,而增殖放流群體(JJ)與其親本QD群體的遺傳距離僅為0.0088。

表3 大竹蟶6個群體遺傳多樣性參數Tab.3 Genetic diversity of the six S.grandis populations

表4 不同群體間的遺傳分化分析Tab.4 Analysis of genetic differentiation among populations

表5 大竹蟶群體間和群體內分子變異的AMOVA分析結果Tab.5 Analysis of molecular variance (AMOVA)within/among S.grandis populations

表6 大竹蟶6個群體間遺傳距離和遺傳分化系數Tab.6 Genetic distance and genetic diversity coefficient of the six S.grandis populations

根據實驗結果計算所得的遺傳距離,通過Mega5.0軟件構建了UPGMA聚類樹。6個大竹蟶群體的聚類結果見圖2。QD群體與JJ群體首先聚為一支,接著與RZ群體聚為一支,QH群體與YK群體聚為另一支,最后與 BH群體聚在一起。150個個體的聚類結果見圖3。由圖3可見,6個群體中大部分個體各自獨立匯聚成一支。只有少數個體出現(xiàn)在其它支系中,該情況QD、JJ群體中各有3個,YK、QH群體各有1個。從不同群體角度來看,個體間的聚類結果與群體間的聚類結果相一致。

圖2 大竹蟶野生群體和增殖放流群體的UPGMA聚類圖Fig.2 The UPGMA phylogenetic tree of stock and wild S.grandis populations

圖3 大竹蟶150個個體的UPGMA聚類圖Fig.3 The UPGMA dendrogram of 150 individuals from the six population of S.grandis

3 討論

3.1 大竹蟶群體間的遺傳多樣性分析

表3顯示,BH群體的PPB、H、I值分別為0.1633、0.2776,和69.45%,為5個野生群體的最高值,QH群體的相應指標則為 0.0982、0.1603和 58.23%,為 5個野生群體的最低值。QH群體遺傳多樣性水平的低下可能與所處海域有關。秦皇島位于環(huán)渤海經濟圈中心地帶,陸域污染源較多,同時自身水動力條件較差決定了該海域自凈能力有限,造成該區(qū)域種群長期遭受環(huán)境污染,從而使得種群數量減少或敏感性個體缺失,群體遺傳多樣性水平下降,大大降低了生物資源的利用率(Krane et al,1999)。

本研究還特別關注了江蘇蔣家沙增殖放流群體,研究分析了增殖放流對群體的遺傳結構的影響。結果表明蔣家沙增殖放流群體 Nei's基因多樣性、Shannon's信息指數和多態(tài)位點百分率分別為0.1054、0.1850、60.17%,而其親本群體即啟東野生群體相應數值則為0.1507、0.2655、66.02%。兩者相比而言,增殖放流群體的各項遺傳多樣性參數均有所下降。推測該結果與下列因素有關: 增殖放流群體親本的選擇區(qū)域狹窄,僅為啟東呂四港附近約 100公頃的海域;且有效親本使用量較低,每年使用親本量大約為50kg。以上情況均可導致培育的苗種在人工繁殖過程中出現(xiàn)近交現(xiàn)象。為避免增殖放流群體的遺傳多樣性下降,可采取的措施有: 一是擴大親本選擇區(qū)域,二是提高親本的數量和品質。

3.2 分子標記的選擇及大竹蟶與其它貝類群體遺傳多樣性的比較分析

通過對幾種基于 PCR技術的分子標記進行比較分析發(fā)現(xiàn),與SSR標記相比,ISSR引物開發(fā)費用低,可以在不同物種間通用。與RAPD單引物相比,ISSR揭示的多態(tài)性百分率較高,而且其具有較高的退火溫度,重復性好,穩(wěn)定性高。相對于AFLP而言,ISSR費用較低,反應體系具有一定的通用性,操作簡單,可廣泛應用。綜合考慮,本研究運用 ISSR標記進行研究相對較好。

表 7列舉了相關海洋經濟貝類分子標記的分析結果,將6個群體大竹蟶的多態(tài)位點百分率、Nei's 基因多樣性指數與其比較,發(fā)現(xiàn)參數相近,說明在群體水平上大竹蟶具有較高的遺傳多樣性。

廣布種貝類如縊蟶(S.constricta)、四角蛤蜊(M.veneriformis)、青蛤(Cyclina sinensis),和西施舌(Mactra antiquata)群體間遺傳差異相對較大(Nei's多樣性指數普遍相差 0.04以上)(表 7),而翡翠貽貝(Penera viridis)和馬氏珠母貝(Pinctada martensi)等僅分布于東南沿海的貝類,其各個群體間遺傳多樣性差異相差甚微(馬氏珠母貝各群體Nei's多樣性指數僅相差0.0003)。由此可見,廣布種比狹域分布的物種具有更多的遺傳差異。本研究結果表明大竹蟶群體間遺傳多樣性水平差異較大(0.0651),符合其作為廣布種的實際情況,為物種水平上的遺傳變異提供了理論基礎。

表7 大竹蟶與其它貝類的遺傳多樣性比較Tab.7 Comparison in genetic diversity between S.grandis and other clams

3.3 大竹蟶群體的遺傳分化狀況

分化系數在 0—0.05之間,群體間分化很弱,0.05—0.15之間表示中等分化,0.15—0.25之間表示分化大,大于 0.25表示分化極大(Wright,1978)。JJ群體與其親本QD群體的Gst＜0.05,表明增殖放流群體與其野生親本群體并沒有產生明顯的遺傳分化。而各野生群體間 Gst在 0.0525—0.0857間,均達到中等分化水平。所有群體間也達到了中等分化水平(0.1370)。該研究結果表明江蘇啟東大竹蟶種質狀況較好,數年來的人工育苗、增殖放流沒有使得啟東群體產生明顯的遺傳變異,依然可以通過增殖放流手段實現(xiàn)對大竹蟶資源的保護。

AMOVA分析結果表明大竹蟶群體間和群體內分化均達到了極顯著水平(P＜0.01)。Φst=0.1268,即在總變異中,87.32%的變異來自群體內,該結果與分析所得的Gst值基本一致。

3.4 大竹蟶群體間的親緣關系分析

遺傳距離是衡量群體間親緣關系的重要指標。Thorp研究認為,遺傳距離D＞0.15的兩個群體,不可能是同一物種;同科屬間 D=0.5—0.9;不同物種間D=0.2—0.8;同種不同群體D=0.03—0.2 (Thorp,1982)。6個大竹蟶群體的遺傳距離大致在0.01—0.04范圍之內,屬于同種不同群體。聚類關系也反映了群體間親緣關系的遠近。本研究的聚類結果顯示,南通的兩個群體(QD,JJ)首先聚為一支,接著與同為南黃海區(qū)域的 RZ群體聚為一支,同為 渤海區(qū)域的 QH群體與YK群體則聚為另一支,最后與南海區(qū)域的 BH群體聚在一起。由此推斷沿海大竹蟶群體間親緣關系和地理距離存在相關性。而導致這一現(xiàn)象的原因是大竹蟶的浮游幼蟲期只有 6—8d (陳愛華等,2009),自然水流的作用只能在較近范圍內形成基因交流。這一原因同樣能夠解釋個體的聚類結果中少數個體出現(xiàn)在鄰近地理群體支系中的現(xiàn)象。

4 結論

本研究分析了我國沿海大竹蟶的遺傳多樣性狀況,并對人工增殖放流活動對野生群體的影響情況進行了評價。結果表明,我國沿海大竹蟶在保持著高遺傳多樣性水平的同時,不同野生地理群體之間已經出現(xiàn)了顯著的分化。開展的增殖放流活動會使得本地野生群體的遺傳多樣性有所下降,但不會產生明顯的遺傳變異?？梢缘贸鼋Y論: 人工增殖放流仍然能夠作為主要的大竹蟶野生資源恢復手段,但在苗種培育過程中,應當在保證親本數量及品質的情況下盡量擴大選擇范圍;同時,注意對本地原種加大保護力度,避免異地繁養(yǎng)帶來的遺傳變異。相關監(jiān)測工作仍需持續(xù)進行,以便對我國沿海大竹蟶資源的保護狀況進行準確的評估。

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