高 瞻 陳 強 黎中寶 ① 李文靜 黃永春 徐安樂 楊 敏

(1.集美大學水產學院 廈門 361021;2.福建省海洋漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室 廈門 361021)

花鱸(Lateolabrax japonicus)又稱鱸魚、七星鱸等,屬硬骨魚綱(Osteichsthyes)、鱸形目(Perciformes)、鮨科(Servanidae)、花鱸屬(Lateolabrax)?；|是廣溫廣鹽性魚類,在日本、朝鮮沿海以及我國沿岸海域均有分布(張春丹等,2005)?；|肉質爽滑鮮美,味道可口。其生長快,適應能力強,淡海水均能養(yǎng)殖,是一種經濟、營養(yǎng)價值極高的魚類,也是我國重要的養(yǎng)殖魚類。迄今關于花鱸的營養(yǎng)研究主要有魚粉替代(Hu et al,2013)、維生素需求量(張璐等,2015)以及添加玉米蛋白粉(Men et al,2014)等,但關于滸苔對花鱸的營養(yǎng)研究還未見報道。

近幾十年來,我國作為世界水產大國,隨著集約化水平的不斷提高,水產品的產量大大超過了全球生產總量的1/3,長達60年之久的海水魚人工養(yǎng)殖已取得巨大成就(Hong et al,2003;Cao et al,2015)。但漁業(yè)的過度開發(fā)與利用已經引發(fā)了一系列問題,如魚類病害,藥物殘留以及環(huán)境污染等。研究新型綠色抗病促長添加劑開始日益得到關注,也已經成為調節(jié)魚體營養(yǎng)、增強魚體免疫性的有效途徑(黎中寶,2004)。

滸苔(Enteromorpha prolifera)俗稱苔條、青海苔等,屬于大型綠藻,隸屬于綠藻門(Chlorophyta)、石莼目(Ulvales)、石莼科(Ulvaceae)、滸苔屬(Enteromorpha)(Hiraoka et al,2003;楊歡等,2013)。滸苔營養(yǎng)物質極其豐富,富含氨基酸、礦質元素等,具有極高的藥用和食用價值。近年來,海洋環(huán)境污染加劇,滸苔大量繁殖,綠潮頻頻暴發(fā)(Nelson et al,2008)。綠潮的頻發(fā)不僅會改變海洋生態(tài)環(huán)境和海洋生物多樣性,還會嚴重污染水質。因此,如何使得滸苔資源被合理有效利用,改善生態(tài)環(huán)境問題,非常值得研究。而國內外也已經有一系列關于滸苔作為飼料添加劑在養(yǎng)殖業(yè)中的報道,如虹鱒(Oncorhynchus mykiss)(Onder et al,2009),大黃魚( Larimichthys crocea)幼魚(Asino et al,2011),大菱鲆(Scophthalmus maximus)(盧青等,2015)以及梭魚(Liza haematocheila)(閆杰等,2012)等。以上研究均表明,飼料添加滸苔對水生動物具有顯著促長,增強免疫力的作用。而滸苔在花鱸中的應用研究未見報道。故本試驗利用發(fā)酵滸苔作為添加劑,探求其對花鱸生長、消化以及免疫性能的影響,為發(fā)酵滸苔在鱸魚飼料中的應用提供理論依據。

發(fā)酵技術是指利用工程技術手段,直接用微生物參與,或者利用菌體細胞或酶的某些功能,通過其代謝活動將底料轉化成我們所需要的產物的一項技術(祝玉洪等,2013)。我國利用微生物發(fā)酵來釀酒早有應用,后在中草藥也有大量研究。隨著發(fā)酵技術的日益成熟,發(fā)酵技術在飼料行業(yè)中應用越來越廣泛。因其可以增加原料風味、改善適口性、提高營養(yǎng)價值而受到歡迎。本試驗初步嘗試開發(fā)利用發(fā)酵滸苔,這對使?jié)G苔成為具有經濟價值的海藻類飼料也有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚及馴養(yǎng)

試驗所用花鱸購于福建省漳浦縣錦興育苗場。置于集美大學海水試驗場循環(huán)過濾桶(1200L)中暫養(yǎng)14d。期間每天兩次定時(7: 30—8: 00,16: 30—17: 00)投喂基礎飼料,并逐漸將其淡化至純淡水養(yǎng)殖。

1.2 試驗設計及試驗飼料

花鱸所用基礎飼料購于廈門市嘉康飼料廠,其主要成分包括魚粉、豆粕、面粉、卵磷脂、維生素和礦物質等(主要營養(yǎng)成分見表 1)。所選用的滸苔于2014年3—5月從廈門龍舟池采集,將采集到的滸苔用海水沖洗干凈,自然晾干。直至滸苔表面無水分后置于 60°C烘箱中進行烘干,之后在冷凍超微粉碎機中進行粉碎,過200目篩制得粉碎好的滸苔粉。將粉碎好的滸苔粉加入 2‰的二型飼料發(fā)酵助劑(購于北京華夏康源科技有限公司),1%的玉米粉作為能量飼料,同時加入65%的蒸餾水,裝入規(guī)格為350*450mm,厚度為10絲的發(fā)酵袋內,密封發(fā)酵3—4 d。得到的發(fā)酵滸苔閉封保存?zhèn)溆?。將發(fā)酵滸苔與基礎飼料按等差數列設計成比例,按逐級擴大法混勻,利用催化成型機配制成對照組(0%)、Diet 1(1%)、Diet 2(2%)、Diet 3(3%)、Diet 4(4%)、Diet 5(5%)六種不同發(fā)酵滸苔添加水平的顆粒型飼料,風干2—3 d,于自封袋內–20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎飼料配方(%干重)Tab.1 Formulation and proximate composition of the basal diet (% dry matter)

1.3 飼養(yǎng)管理

在暫養(yǎng)結束后挑選出體格健壯、規(guī)格一致的花鱸苗540尾[初始體重為(6.40±0.14)g],隨機分配到18個設有循環(huán)過濾水系統的玻璃水族缸(40cm × 40cm × 70cm)中,共分為6個處理組,每處理組3個重復。在試驗期間每天同樣兩次定時(7: 30—8: 00,16: 30—17: 00)飽食投喂。喂食 30min后收集殘餌,烘干,稱量,確保得到準確飼料攝入量。然后吸糞換水,保持24h不間斷充氣增氧。試驗期間水溫(26±1)°C、pH(8.0±0.2)、溶氧≥7 mg/L、氨氮濃度＜0.2 mg/L。每天觀察記錄花鱸攝食與生長狀況,記錄水溫以及死亡情況。

1.4 樣品采集及處理

飼喂28d后,將花鱸饑餓24h,采用丁香酚麻醉,對各試驗缸魚進行整體稱重和計數。每缸隨機撈取5尾魚測體質量和體長,采用 1mL無菌注射器對其進行尾部靜脈取血。將收集得到的血樣靜置 12h后在3000r/min條件下離心 10min,收集上層血清置–80°C冰箱保存用于分析血清生化指標。同時將其進行解剖,快速分離肝臟,胃,腸道。將肝臟稱重以計算肝體指數,然后分裝入凍存管投入液氮后轉移至–80°C冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｃ扛纂S機選取3只花鱸保存于–80°C冰箱用于全魚體成分的測定。

1.5 測定指標

1.5.1 生長指標分析 對試驗魚生長性能指標測定時所用公式為:

1.5.2 體成分分析分析 魚體稱濕重后于70°C烘至恒重,再次稱重。水分的測定采用105°C常壓烘箱干燥恒重法。將烘干的魚體絞碎,采用半微量凱氏定氮法(總氮×6.25)測粗蛋白;索氏抽提法(乙醚為抽提液)測粗脂肪;馬福爐灼燒法(550°C)測灰分。

1.5.3 腸、胃消化酶活性測定 將胃和腸道稱重,按1 : 9 (V/W)加入4°C的0.85%生理鹽水,在冰水浴中勻漿 5min。采用低溫高速離心機(4°C,3000r/min,15min)對勻漿液進行離心,吸取上清于–80°C冰箱保存待測消化酶。測定指標有胰蛋白酶、胃蛋白酶、腸、胃道淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)活性,測定所用相應試劑盒均由南京建成生物工程研究所生產,操作步驟按照說明書進行。

1.5.4 血清、肝臟免疫酶活性測定 將肝臟稱重,加入9倍體積(V/W)的85%生理鹽水(4°C),用勻漿器冰水浴勻漿5 min,再用低溫高速冷凍離心機3000 r/min離心15 min,取上清液制成20%的組織勻漿。測定指標有血清、肝臟總超氧化物歧化酶(T-SOD)、溶菌酶(LZM)和堿性磷酸酶(AKP)活性均采用南京建成生物工程研究所生產的相應試劑盒測定,操作步驟按照說明書進行。

1.5.5 統計方法 試驗所得數據均用SPSS19.0統計軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA),利用Duncan法進行多重比較,取顯著水平P＜0.05。試驗所得數據均以平均數±標準誤進行表示。

2 結果

2.1 發(fā)酵滸苔對花鱸生長性能的影響

發(fā)酵滸苔對花鱸生長性能影響見表 2,飼料中添加發(fā)酵滸苔顯著提高了花鱸的增重率和特定生長率(P＜0.05)(表 3)。生長實驗結果表明添加水平在 Diet 2(2%)時增重率和特定生長率達到最大,比對照組分別顯著提高了45.2%、18.2% (P＜0.05),但添加組與對照組相比不存在顯著差異(P＞0.05)。隨發(fā)酵滸苔添加濃度的上升,各實驗組花鱸飼料系數呈現先降低后升高的趨勢,Diet 3(3%)組花鱸的飼料系數顯著低于對照組 16.6% (P＜0.05)。各組肥滿度均無顯著差異(P＞0.05),各組存活率均為100%。

由表3可知,以特定生長率、飼料系數為指標作最佳擬合曲線,花鱸魚飼料中發(fā)酵滸苔的最佳添加水平分別為2.91%、2.71%。

表2 發(fā)酵滸苔對花鱸生長的影響Tab.2 Effects of fermented E.prolifera on the growth performance of L.japonicus

表3 擬合方程: 以特定生長率、飼料系數為指標Tab.3 SGR,FCR of Fitting equations

2.2 發(fā)酵滸苔對花鱸魚體成分的影響

由表4可知: 添加發(fā)酵滸苔可適當降低魚體中的水分,提高灰分含量但并不顯著(P＞0.05)。同時各添加組的粗脂肪和粗蛋白含量均高于對照組,各添加組之間并無顯著性差異(P＞0.05)。

2.3 發(fā)酵滸苔對花鱸胃、腸道消化酶活性的影響

由表 5可以看出,在發(fā)酵滸苔添加濃度為 2%—3%時胰蛋白酶,腸淀粉酶,腸脂肪酶活性明顯高于其余各組(P＜0.05),隨著添加濃度的繼續(xù)上升,呈現出下降的趨勢。胰蛋白酶在添加水平Diet 2(2%)時活性達到最高。腸淀粉酶和脂肪酶則在Diet 3(3%)時達到最高,處理組各組差異不顯著(P＜0.05),且均高于對照組(P＞0.05)。

花鱸攝食試驗料后對胃中消化酶活性影響見表5,添加組中花鱸胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶均得到顯著的提高(P＜0.05),且隨著發(fā)酵滸苔添加濃度的上升呈現先上升后下降的趨在添加水平為 Diet 3(3%)時胃蛋白酶活性最高,且各處理組與對照組差異性顯著(P＜0.05)。各組定粉酶,脂肪酶在添加水平為Diet 2(2%)時活性最高,各添加組均顯著高于對照組(P＜0.05),但各添加組之間的脂肪酶并無顯著差異(P＞0.05)。在發(fā)酵滸苔添加量為 2%—3%濃度范圍時花鱸的胃消化酶活性達到最高且顯著高于對照組(P＜0.05)。

表 6為以各消化酶為指標所得出的擬合曲線方程,由表可知花鱸魚飼料中發(fā)酵滸苔的最佳添加水平為2.50%—3.00%。

表4 發(fā)酵滸苔對花鱸體成分的影響(濕重%)Tab.4 Effects of fermented E.prolifera on the whole-body composition of L.japonicus (wet weight %)

表5 發(fā)酵滸苔對花鱸消化酶的影響Tab.5 Effects of fermented E.prolifera on the activities of digestive enzymes of L.japonicus

2.4 發(fā)酵滸苔對花鱸血清、肝臟中免疫酶活性的影響

發(fā)酵滸苔對花鱸血清免疫酶的活性影響見表7。由表可知,飼料中添加發(fā)酵滸苔可提高處理組鱸魚血清的堿性磷酸酶活性,在Diet 2(2%)組活性達到最大,但差異不顯著(P＞0.05)。隨著添加發(fā)酵滸苔濃度的不斷增高,鱸魚血清中溶菌酶的活性呈現先上升后逐漸下降的趨勢,在 Diet 2(2%)組活性達到最大,并且顯著高于其余各組(P＜0.05)。添加組血清中總超氧化物歧化酶活性顯著高于對照組(P＜0.05),但添加組各組之間差異不顯著(P＜0.05)。

表6 擬合方程: 以消化酶活性為指標Tab.6 Activities of digestive enzymes of Fitting equations

表7 發(fā)酵滸苔對花鱸血清免疫酶的影響Tab.7 Effects of fermented E.prolifera on the immune response of L.japonicus

由表8可知,飼料中添加發(fā)酵滸苔可顯著提高添加組鱸魚肝的堿性磷酸酶活性(P＜0.05),在Diet 2(2%)組活性達到最大,但各添加組之間差異不顯著(P＞0.05)。在添加濃度為 2%—3%之間花鱸肝的溶菌酶活性顯著高于其余各組(P＜0.05),其余添加組與對照組之間不存在差異性(P＞0.05)。隨著添加發(fā)酵滸苔濃度的不斷增高,鱸魚肝中總超氧化氫歧化酶的活性呈現先上升后逐漸下降的趨勢,在Diet 2(2%)組活性達到最大,并且顯著高于其余各組(P＜0.05)。

表 9為以各免疫酶為指標所得出的擬合曲線方程,由表可知花鱸魚飼料中發(fā)酵滸苔的最佳添加水平為2.41%—3.00%。

表8 發(fā)酵滸苔對花鱸肝的免疫酶影響Tab.8 Effects of fermented E.prolifera on the immune response of L.japonicus

表9 擬合方程: 以免疫酶活性為指標Tab.9 Immune response of Fitting equations

3 討論

3.1 發(fā)酵滸苔對花鱸生長的影響

滸苔是一種優(yōu)質的大型天然海藻,含有豐富的蛋白質、礦物質、維生素等,營養(yǎng)價值及其利用率都非常高。Asino等(2011)研究了飼料中添加滸苔對大黃魚幼魚生長的促進作用,研究結果表明添加滸苔可以顯著提高其特定生長率,存活率均達到 97%以上。閆杰等(2012)在餌料中添加滸苔探究對梭魚(Liza haematocheila)生長效果影響,結果表明添加滸苔組可以顯著提高梭魚的特定生長率,降低飼料系數。王曉蘭等(2014)在大菱鲆(Scophthalmus maximus)配合飼料中添加復方中草藥提取液、L-甘氨酸和干滸苔粉,結果表明滸苔添加組的大菱鲆的增重率得到了提高。在本試驗中,滸苔添加組顯著提高了鱸魚的生長性能,并且在一定添加濃度內,鱸魚的增重率和特定生長率逐漸上升,其原因可能是由于滸苔蛋白質、不飽和脂肪酸含量高,脂肪含量低,且含有生物活性物質如多糖、萜類和甾體等(李曉等,2013),具有增強免疫力,調節(jié)機體代謝,促進鱸魚生長的作用。Y?ld?r?m等(2009)探究了將10%的滸苔粉作為配合飼料添加對虹鱒(Oncorhynchus mykiss)生長效果的影響,結果表明添加 10%滸苔粉會降低魚的生長速度和飼料利用率。在Yousif等(2004)對黃斑藍子魚飼料中添加滸苔的研究中也發(fā)現在添加量為 10%時可以提高魚體增重率。但隨著添加量由10%、20%到30%的增加,魚體的增重率、生長效率會逐漸降低,同時提高飼料系數。這些結果與本試驗中得到的一致。雖然在本試驗中發(fā)酵滸苔的添加量最高只達到 5%,但隨著滸苔添加量的增多而降低原因可能是由于添加量過大而降低了飼料適口性所致,但具體研究機制仍需進一步探索。楊春花等(2012)對海藻粉進行發(fā)酵后再添加到基礎日糧中飼喂 1日齡櫻桃谷肉鴨(Cherry Valley Ducks),研究結果表明其大大高肉鴨采食量、日增重以及降低飼料系數。本試驗對滸苔進行發(fā)酵后對花鱸進行研究同樣提高了花鱸的增重率,降低了飼料系數。分析其原因可能是在發(fā)酵時破壞了滸苔所含的膠質所致,使營養(yǎng)物質更容易被吸收,避免了因利用率低而造成的浪費。

另外,在本試驗中添加滸苔可以降低鱸魚的肝體指數、魚體水分含量,提高粗蛋白和粗灰分含量。從而在一定程度上改善魚肉品質,提高產品質量。在Asino等(2011)的研究結果中添加滸苔可以提高其粗脂肪、粗灰分含量,結果基本一致。

3.2 發(fā)酵滸苔對花鱸胃、腸道消化酶的影響

魚類消化酶活性反應的是魚類對營養(yǎng)物質的吸收利用情況,同一種消化酶在不同消化器官中分布將存在差異。微生物發(fā)酵不僅可以改變飼料理化性質,還可以降解底物中的大分子有機物,從而使消化利用率得到提高(李猛等,2015)。通過微生物發(fā)酵產物作為飼料添加劑研究花鱸的消化酶活性的試驗并不多見,本試驗在一定程度上彌補了類似研究的不足。本試驗證明對滸苔進行發(fā)酵后,不但提高了飼料的適口性,而且也顯著提高花鱸的消化性能。Wang等(2006)、Suzer等(2008)研究表明,消化性能的增強可能是提高魚類生長率一個原因。楊春花等(2012)的研究中,將海藻粉發(fā)酵后飼喂 1日齡櫻桃谷肉鴨(Cherry Valley Ducks)后發(fā)現,由于發(fā)酵工藝降低了滸苔的纖維素含量,使得滸苔所含營養(yǎng)物質更加利于肉鴨的消化吸收,進而提高了肉鴨的消化性能,因此顯著提高了其生長速度。孫建鳳等(2010)在肉雞飼糧中添加滸苔,結果發(fā)現肉雞的胃蛋白酶、胰蛋白酶以及淀粉酶活性都得到了顯著提高。王述柏等(2013)研究表明飼料中添加4%的滸苔可以提高肉雞腸淀粉酶、脂肪酶以及蛋白酶活性。這均與本試驗結果較為一致。夏素銀等(2010)利用發(fā)酵蛋白飼料替代豆粕研究其對肉仔雞消化吸收的影響,發(fā)現提高了其養(yǎng)分消化率。本試驗所研究的滸苔就是一種高蛋白的海藻,故該研究結果對本試驗具有一定的參考價值。秦搏等(2015)發(fā)現添加滸苔粉可以顯著提高幼刺參(Apostichopus japonicus Selenka)的淀粉酶和胃蛋白酶,其中以添加水平25%含量為最優(yōu)。這與本試驗中2%含量為最佳相差較大,究其原因一方面可能是因為研究對象不同而差異,另一方面可能是因為滸苔經過發(fā)酵后大大提高了其利用率,故使其最適添加水平得以降低。

3.3 發(fā)酵滸苔對花鱸血清、肝臟免疫指標的影響

魚類生存環(huán)境具有特殊性,因此在抵抗病害方面非特異性免疫機制比特異性免疫顯得更為重要(Anderson,1992)。本研究選取超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)和堿性磷酸酶(AKP)這三種具有代表性的非特異性免疫酶指標對花鱸非特異性免疫性能進行說明。超氧化物歧化酶反應了機體清除多余自由基的能力,是一種重要的抗氧化酶。溶菌酶(LZM)具有較強殺菌作用,可促進機體細胞的吞噬活性,可在機體啟動免疫保護時發(fā)揮作用。本試驗在基礎飼料中添加不同水平的發(fā)酵滸苔進行投喂后,結果表明添加發(fā)酵滸苔可以明顯提高花鱸血清、肝臟的免疫性能。徐大倫等(2005)研究發(fā)現向扇貝(Chlamys farreri))體內注射滸苔多糖后,扇貝體內超氧化物歧化酶和溶菌酶活性得到明顯提高,進一步論證了滸苔具有促進機體免疫活性的作用。Castro等(2004)研究證實綠藻類的滸苔能夠提高大菱鲆的呼吸活性,從而加強噬菌細胞中巨噬細胞殺死細菌病原體的能力。唐薇等(2014)在研究中發(fā)現滸苔粉能促進刺參組織的免疫性能。王述柏等(2013)在日糧中添加滸苔粉顯著提高了肉雞的免疫力。這些結果都說明了添加滸苔具有提高機體免疫性能的作用,與本試驗結果較為吻合。盧青等(2015)采用滸苔粉作為飼料添加劑對大菱鲆(Scophthalmus maximus)的試驗研究得出,當添加量在 5%時并不會提高大菱鲆的免疫力,且隨著添加量繼續(xù)增高反而抑制其免疫活性。在本試驗中,在發(fā)酵滸苔在添加量為 5%仍可增加機體免疫力,且在添加量為 3%時達到最佳。同時也隨著添加量的增高呈降低趨勢,這點與盧青的研究相符合。但就添加量 5%能否提高魚體免疫力上與盧青的研究不一致,原因可能是盧青等采用的是滸苔粉,而本試驗采用的是發(fā)酵滸苔,發(fā)酵滸苔中的發(fā)酵菌隨底物進入機體環(huán)境,并作為外源微生物激發(fā)免疫,增加了具有殺菌作用的體液因子,從而有效提高機體免疫力。同樣在姜燕(2014)研究實驗中發(fā)現,與未發(fā)酵的飼料相比發(fā)酵飼料能提高刺參(Apostichopus japonicus Selenka)的超氧化物歧化酶、溶菌酶等非特異性免疫酶的活性。由此可以推知,對滸苔進行發(fā)酵處理所得到的效果可能好于未經過發(fā)酵處理的滸苔。

4 結論

在本試驗條件下,飼料中添加發(fā)酵滸苔能夠促進花鱸的生長,降低花鱸魚體水分含量,在一定程度改善花鱸魚肉品質。還可以提高飼料利用率,增強花鱸胃、腸道消化酶活性從而改善花鱸魚的生長狀況。并且對花鱸免疫力也有顯著提高,增強花鱸抗病能力。

通過生長指標,消化指標以及免疫指標等重要指標的最佳擬合曲線可得知,在添加濃度為2%—3%時能顯著提高其生長性能,消化性能和免疫性能。

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