伍 琴 唐建洲 劉 臻 ① 趙玉蓉 郝 光 魯雙慶

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 長沙 410128;2.湖南省水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心 常德 415000;3.長沙學(xué)院生物與環(huán)境工程系 長沙 410003)

?；撬?2-氨基乙烷磺酸)是一種能在魚體內(nèi)自主合成的含硫非蛋白氨基酸。對魚體內(nèi)的營養(yǎng)生理具有很大作用,如影響動物視力和神經(jīng)系統(tǒng),調(diào)節(jié)細胞滲透壓,促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,提高魚的生長性能等。越來越多的研究者把?；撬崽砑拥斤暳现?探討牛磺酸對淡水魚和海水魚養(yǎng)殖的生理、代謝、及營養(yǎng)的影響(Li et al,2009;El-Sayed et al,2013)。?；撬嵩隰~體內(nèi)可以通過游離氨基酸的代謝自身合成,但是多數(shù)魚類尤其是淡水魚類自身合成的?；撬釢舛群艿?不能滿足自身生長需求,必須通過飲食來補充。已有研究表明,在飼料中添加?；撬崮芴岣呶鍡l鰤的繁殖能力(Matsunari et al,2006);在魚飼料中添加?；撬崮芴岣唢暳侠寐屎汪~的生產(chǎn)性能(Takagi et al,2006a,2006b,2010,2011;Yamamoto et al,2000)。添加適量牛磺酸的飼料提高了黃河鯉魚的胰腸蛋白酶活性(高春生等,2007)。但是有關(guān)?；撬嵊绊戹a魚生長性能、腸道細胞增殖和蛋白質(zhì)消化吸收的機理研究尚未見報道,因此本試驗旨在飼料中添加不同劑量的?；撬?研究?；撬釋a魚生長性能,腸道黏膜形態(tài),以及蛋白消化吸收相關(guān)基因表達的影響,以期能為?；撬釕?yīng)用于水產(chǎn)動物營養(yǎng)以及?；撬釋λa(chǎn)動物的作用機理提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

配制6種等氮等能飼料,飼料蛋白源主要是豆粕和魚粉,飼料脂肪源主要是豆油和魚油,飼料糖源則主要由面粉和淀粉提供。參考文獻(Matsunari et al,2006;Xie et al,2014),在鯽魚基礎(chǔ)飼糧中添加?；撬岬膭┝糠謩e為 0.0、1.0、2.5、4.0、6.0以及 9.0g/kg (牛磺酸由上海明豐生物科技有限公司提供,分析純)。飼糧原料粉碎后用 40目篩篩凈雜質(zhì),飼料原料混勻采用的是由小比重成分到大比重成分逐級擴大的方法,制粒前把魚油等脂肪源與水預(yù)混合再加到混合好的原料中充分混勻,用 SLX-80型軟顆粒飼料機加工成直徑為1.5 mm的硬顆粒飼料。分析飼料成品得知各組飼糧中?；撬岬臏?zhǔn)確含量分別為 2.1、2.99、4.4、5.7、7.5、10.1 g/kg,基礎(chǔ)飼料配方如表1所示。

表1 基礎(chǔ)飼糧的組成(%)及營養(yǎng)水平Tab.1 Composition and nutrient levels of the basal fodder

1.2 試驗用魚的養(yǎng)殖管理

選取同批孵化、體質(zhì)健壯的鯽魚(由湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所提供),初始體重為(29.07±0.19)g,飼喂周期為8周。試驗共設(shè)6個處理組,每個處理組分為4個重復(fù),每個重復(fù)有魚20尾。養(yǎng)殖試驗于2014年7—9月在長沙學(xué)院產(chǎn)學(xué)研基地室內(nèi)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行,養(yǎng)殖用缸規(guī)格為120cm×80cm×80cm。試驗開始后,每日定點定時投喂3次,均為飽食投喂,飼喂期間養(yǎng)殖缸每天不斷增氧,水溫控制在 24—27°C,pH 控制在6.5—7.5。每天測量水溫、記錄投喂量和觀察攝食情況。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測定

1.3.1 生產(chǎn)性能指標(biāo) 8周養(yǎng)殖試驗結(jié)束,停食24h后采樣,分別稱取每缸魚體重并記錄尾數(shù),算出每缸魚的平均體重、增重率(weight gain rate,WGR)、特定生長率(special growth rate,SGR)、飼料系數(shù)(feed coefficient,FC)、蛋白質(zhì)效率(protein efficiency ratio,PER)。計算公式如下:

增重率(WGR,%)= (末均重－初均重)/初均重×100%;

特定生長率(SGR,%/d)= (ln末均重－ln初均重)/實驗天數(shù)×100%;

飼料系數(shù)(FC)= 總攝食量/(末總重－初總重);

蛋白質(zhì)效率(PER)= (末均重－初均重)/(尾均攝食日糧總量×飼糧粗蛋白含量)。

1.3.2 血清生化指標(biāo) 試驗結(jié)束后,從每缸魚中隨機撈選 3尾魚進行尾靜脈采血,迅速摘下針頭并將血液注入已滅菌的1.5mL EP管中,4°C靜置直至析出大量血清,4000 r/min離心10 min,取血清保存在–80°C待測。血清中 T3、T4、尿素氮、葡萄糖等血清生化指標(biāo)由中國人民解放軍第163醫(yī)院檢測得到。

1.3.3 腸道黏膜形態(tài)測定 養(yǎng)殖結(jié)束后,每缸隨機撈取魚3尾,解剖后分離腸道,用0.1 mol/L PBS溶液輕輕沖洗腸道,用 4%多聚甲醛溶液固定中腸,按照石蠟切片的制作程序(脫水、石蠟包埋、切片和H-E染色)制出切片,在 10×10顯微鏡下觀察并拍照。每張切片隨機選10—20根平整完好的的絨毛,用軟件Image-pro plus6.0測量其高度及相鄰的隱窩深度[測量方法參考孫浪(2013)],算出絨毛高度與隱窩深度的比值,最后把各指標(biāo)的平均數(shù)作為測定數(shù)值。

1.3.4 腸道蛋白質(zhì)消化吸收相關(guān)基因相對表達的測定 養(yǎng)殖結(jié)束后,每缸魚隨機取3尾,在無菌環(huán)境下于冰盒上解剖后分離出腸道,用剪刀剪碎裝入無RNAse EP管中,迅速投入液氮中保存,用于基因表達的分析,全程低溫操作。

1.3.5 熒光定量引物設(shè)計 用Tritrol試劑(TaKaRa)提取鯽魚腸道樣品中總 RNA,隨后用 PrimeScript RT reagentKit (Perfect Real Time)(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄得到單鏈cDNA。從GenBank中查詢并下載鯽魚的氨肽酶N (Aminopeptidase,APN)、小肽轉(zhuǎn)運蛋白(Peptide Transporter,PepT1)、基因系尾型同源盒基因(caudal homeobox genes,CDX2)、L-氨基酸轉(zhuǎn)運載體蛋白(L-transport carrier protein amino acids,LAT2)基因序列全長,找到ORF區(qū),實時熒光定量 PCR(Real-time PCR)特異引物用Primer Express 3.0軟件設(shè)計,內(nèi)參基因引物根據(jù)鯽魚管家基因β-actin設(shè)計(見表2)。

表2 熒光定量分析的目的基因與內(nèi)參基因的引物參數(shù)Tab.2 Primers used for real-time quantitative PCR analysis

Real-time PCR擴增采用SYBR Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa)和 BIO-RAD CFX96TMReal-time PCR儀進行Real-time PCR擴增。 PCR 反 應(yīng) 體 系為: SYBR Premix ExTaq 6 μL;正向引物(10 μmol/L)0.5 μL;反向引物(10 μmol/L)0.5 μL;模板 0.5 μL;雙蒸水5 μL;總體積為 12.5 μL,每個樣品3個重復(fù)。RT-PCR結(jié)束后,從擴增曲線得出Ct值,通過公式RQ=2–△△Ct[ΔΔCt=(Ct目的基因－Ct管家基因)－ΔCt校準(zhǔn)樣]計算得出目的基因的相對表達量,最后用Sigmaplot軟件作圖。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

用 Image-pro plus6.0軟件分析腸道切片圖,所有數(shù)據(jù)都用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)”的表示方法,并用 Excel 2007進行初步數(shù)據(jù)統(tǒng)計,用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA),采用Duncan進行多重比較,檢驗不同組間的差異是否顯著,以P＜0.05為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。柱狀圖由專業(yè)制圖軟件 Sigmaplot制出。

2 結(jié)果與分析

2.1 ?；撬釋a魚生產(chǎn)性能的影響

從表3可見,1.0、2.5、4.0和9.0 g/kg四個處理組與對照組相比較,鯽魚的增重率、特定生長率、飼料系數(shù)差異不顯著(P＞0.05),當(dāng)?；撬崽砑恿繛?.0 g/kg時,鯽魚的增重率、特定生長率、飼料系數(shù)顯著高于對照組及其它處理組(P＜0.05)。從表3還可知,1.0、2.5和9.0 g/kg三個處理組與對照組相比,鯽魚蛋白質(zhì)效率差異不顯著(P＞0.05),4.0 g/kg和6.0 g/kg處理組蛋白質(zhì)效率顯著高于對照組及其它處理組(P＜0.05)。

2.2 ?；撬釋a魚血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知,血清中T3、T4隨著?；撬釀┝康脑黾?各試驗組整體呈先增加后下降的變化趨勢,牛磺酸濃度6.0 g/kg時,T3、T4在血清中濃度最高,顯著高于對照組和1.0 g/kg、2.5 g/kg處理組(P＜0.05)。各試驗組血清葡萄糖濃度差異不顯著(P＞0.05),尿素氮濃度差異顯著(P＜0.05),6.0 g/kg處理組中尿素氮濃度顯著低于對照組和其它處理組(P＜0.05)。

2.3 ?；撬釋a魚腸道細胞增殖的影響

由表5可知,絨毛高度整體上隨著?；撬釢舛鹊脑黾佣壬仙笙陆?隱窩深度則隨著牛磺酸濃度的增加先降低后增加。當(dāng)飼料中牛磺酸濃度為6.0 g/kg時,鯽魚絨毛高度達到最高值,隱窩深度達到最小值,且都顯著區(qū)別于對照組和其它處理組(P＜0.05)。而且,各試驗組的絨毛高度/隱窩深度的比值隨著?；撬釢舛鹊脑黾酉仍龃蠛鬁p小,添加6.0 g/kg時達到最高值(見圖1)。

2.4 牛磺酸對腸道蛋白吸收調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達的影響

如圖2、圖3所示,APN、PepT1、LAT2、CDX2 mRNA的相對表達量隨著牛磺酸添加量的增加整體上都呈先上升后下降的變化趨勢,添加6.0 g/kg時處于最高值,顯著高于對照組和其它處理組(P＜0.05)。從圖2可看出,1.0和4.0和6.0 g/kg處理組的APN mRNA的相對表達量顯著高于對照組(P＜0.05);PepT1 mRNA表達量在6.0 g/kg處理組時顯著高于其它試驗組(P＜0.05),除6.0 g/kg處理組之外的其它組間則差異不顯著(P＞0.05)。由圖3可看出,LAT2在 4.0 g/kg和6.0g/kg處理組時表達量顯著高于其它試驗組(P＜0.05)。CDX2 mRNA在6.0g/kg和9.0 g/kg處理組的相對表達量高于對照組和其它處理組(P＜0.05)。綜上說明添加適量的?；撬崮艽龠MAPN、PepT1、LAT2和CDX2 這4個基因的表達,而添加量過低或者是過 高則不起作用或者起抑制的效果。

表3 不同牛磺酸量對鯽魚生產(chǎn)性能的影響Tab.3 Effects of different concentrations of taurine on growth performance of crucian carp

表4 不同?；撬崃繉a魚血液生化指標(biāo)的影響Tab.4 Effect of taurine in different concentrations on biochemical indices in crucian carp serum

表5 不同牛磺酸量對鯽魚腸道黏膜形態(tài)的影響Tab.5 Effect of taurine in different concentrations on intestinal mucosa morphology of crucian carp

3 分析與討論

國內(nèi)外有關(guān)?；撬嵊绊懰a(chǎn)動物生產(chǎn)性能的研究報道很多,Takagi等(2006b)用添加不同梯度牛磺酸的飼料飼喂黃魚,研究結(jié)果表明,飼喂 21周后,0添加牛磺酸組的魚的增重,飼料效率明顯比添加組低,而死亡率則更高。Takagi等(2006a)在飼料中添加梯度劑量的?；撬犸曃?1年齡的紅鯛魚,發(fā)現(xiàn)?；撬崽砑咏M的特定生長率和飼料利用率得到明顯的改善。本試驗結(jié)果表明,在飼料中添加一定劑量的牛磺酸對鯽魚有明顯的促生長和促進飼料利用的作用,6.0 g/kg?；撬崽幚斫M的生產(chǎn)指標(biāo)最優(yōu),顯著優(yōu)于對照組和其它處理組(P＜0.05),本研究結(jié)果與上述報道相似。

甲狀腺激素的主要作用是通過加快新陳代謝來促進機體的生長發(fā)育。T3、T4都是機體的重要代謝激素,與生長激素密切相關(guān),其水平的高低影響著機體代謝水平、生長快慢(宋永,2002;楊小然,2012)。本試驗結(jié)果顯示,T3、T4都隨著?；撬崽砑訚舛鹊脑黾佣仍黾雍鬁p少,當(dāng)添加濃度達到6.0 g/kg時,T3、T4都達到最高值,這與郭鵬飛(2004)研究?；撬釋θ怿喲荷笜?biāo)的結(jié)果一致。血清尿素氮含量主要反映體內(nèi)氨基酸的代謝效率,血清中尿素氮含量的增加是因為過量的氨基酸在體內(nèi)進行脫氨作用,有研究報道,尿素氮含量與蛋白質(zhì)利用率及日增重呈負相關(guān)(Whang et al,1994)。本試驗結(jié)果顯示,1.0、4.0、6.0 g/kg?；撬崽砑咏M的尿素氮含量顯著低于對照組(P＜0.05),其中6.0 g/kg處理組最低,表明鯽魚飼料中添加?；撬峥山档脱迥蛩氐獫舛?這一研究結(jié)果與劉玉芝等(2008)的肉仔雞?；撬嵩囼灲Y(jié)果相互佐證。

圖2 ?；撬釋a魚腸道APN、PepT1 mRNA相對表達量的影響Fig.2 Effect of taurine on APN,PepT1 mRNA relative expression of the crucian carp

圖3 ?；撬釋a魚腸道 LAT2、CDX2 mRNA相對表達量的影響Fig.3 Effect of taurine on LAT2,CDX2 mRNA relative expression of the crucian carp

腸絨毛作為機體的主要消化和吸收場所,是腸黏膜的主要結(jié)構(gòu)。衡量小腸吸收功能的指標(biāo)主要是腸絨毛高度、隱窩深度及絨毛高度與隱窩深度的比值(韓正康,1991;晁洪雨,2008)。腸絨毛高度增加使腸道吸收面積加大,對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率得到提高,消化功能增強,提高魚的生長性能和飼料系數(shù)。隱窩變淺使腸道分泌功能加強(成令忠,1994),能分泌更豐富的激素,酶類,提高了腸道的消化吸收能力。腸絨毛吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力隨著腸絨毛高度與隱窩深度比值的增高而加強,反之則減弱(郭元晟等,2011;郭志強等,2012)。張建斌等(2011)報道,在飼料中添加牛磺酸能極顯著提高豬十二指腸的絨毛長度和降低隱窩深度,極顯著提高十二指腸段和空腸中腸段的絨毛長度/隱窩深度。本試驗結(jié)果與以上試驗結(jié)果相似,添加適量的?；撬崮苁沟酶吣c絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度的比值得到顯著提高,隱窩深度顯著降低,尤其是6.0 g/kg添加量時,各數(shù)據(jù)均顯示達到了最佳。

?；撬嵊绊戵w內(nèi)蛋白質(zhì)的消化吸收效率,根本原因是?；撬釋φ{(diào)控蛋白質(zhì)水解、轉(zhuǎn)運、吸收相關(guān)基因表達起了調(diào)控作用。APN作為魚類腸道中水解各種蛋白質(zhì)的關(guān)鍵酶,能夠把 N端多肽鏈水解成游離氨基酸,對魚類的消化有著至關(guān)重要的作用(Nakainishi et al,2002)。PepT1對大多數(shù)二肽和三肽都具有很高的轉(zhuǎn)運活性,在蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物吸收中發(fā)揮關(guān)鍵作用(張云華等,2003)。CDX2在腸道中主要對腸道上皮形態(tài)發(fā)生,維持和分化起作用,是腸道上皮細胞的一種特異性核轉(zhuǎn)錄因子(Yuasa et al,2005),還調(diào)控一些對腸道消化吸收起關(guān)鍵性作用的功能基因的表達(馮幼等,2009)。LAT2負責(zé)轉(zhuǎn)運支鏈氨基酸和芳香族氨基酸、中性氨基酸和一些必需氨基酸(Kanai et al,1998)。本試驗結(jié)果顯示,牛磺酸對 APN、PepT1、LAT2、CDX2 mRNA的相對表達量的影響整體上都是一個先上升后下降的變化趨勢,當(dāng)?；撬釢舛冗_到6.0 g/kg時處于最高值,顯著高于對照組和其它對照組(P＜0.05),這與Matsunari等(2005)研究?；撬釋S鰤魚幼魚的影響的研究結(jié)果相似,即?；撬崮苡绊懓被岽x。以上研究結(jié)果揭示?；撬嵬ㄟ^調(diào)節(jié)APN、PepT1、LAT2、CDX2 mRNA在鯽魚腸道中的相對表達量來調(diào)控蛋白質(zhì)的水解,小肽的轉(zhuǎn)運以及氨基酸的消化吸收,最終影響到鯽魚的生長性能。

4 結(jié)論

(1)飼料中添加適量的?；撬崮芴岣喏a魚的生長性能、蛋白質(zhì)效率、飼料系數(shù)、及鯽魚腸道細胞的增殖和血清中T3、T4的濃度。

(2)飼料中添加適量的牛磺酸能上調(diào)鯽魚腸道中APN、PepT1、LAT2、CDX2 mRNA的相對表達量。

(3)飼料中添加?；撬釕?yīng)注意適量原則。

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