劉曉輝 王健鑫 王帥兵 樊英萍 俞凱成 蔣 然 劉明華

(浙江海洋學(xué)院海洋微生物分子生態(tài)與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室 舟山 316022)

海洋約占地球表面積的 71%,浩瀚的海洋中有著豐富的生物資源,而海洋微生物以其數(shù)量大、種類(lèi)多、分布廣及適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)在其中占據(jù)舉足輕重的地位。特定環(huán)境下的微生物群落結(jié)構(gòu)不僅可以反映微生物所處的生境特點(diǎn),同時(shí)也能說(shuō)明微生物在生態(tài)系統(tǒng)中的功能及其在生物地球化學(xué)循環(huán)中所起的作用(Lu et al,2008),因此通過(guò)分析自然環(huán)境中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)來(lái)研究生態(tài)學(xué)、環(huán)境學(xué)及全球變化,有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

長(zhǎng)江是我國(guó)第一大河,平均年入海徑流量約9.28×1011m3,占輸入東?？倧搅髁康?4.4%,在陸源物質(zhì)向東海的輸送中起著重要作用(張東聲,2011)。大量營(yíng)養(yǎng)鹽、污染物等輸入長(zhǎng)江口及東海,對(duì)河口和沿岸海域的水文、沉積過(guò)程、地貌變化、生物生態(tài)等產(chǎn)生重要影響,另外長(zhǎng)江口及鄰近海域還受到臺(tái)灣暖流、浙江近岸流和黃海沿岸流等水系的共同作用(Ning et al,2011),強(qiáng)烈的季風(fēng)氣候通過(guò)海氣相互作用也影響東海的環(huán)流和溫鹽結(jié)構(gòu),這種多水系的匯合、復(fù)雜的水文狀況和日益頻繁的人類(lèi)活動(dòng)干擾,使該海域不僅是我國(guó)海岸帶陸-海相互作用研究的關(guān)鍵水域(寧修仁等,2004),也是典型近岸生態(tài)系統(tǒng)研究的重要區(qū)域。

近年來(lái),關(guān)于長(zhǎng)江口及鄰近海域微生物多樣性的研究日益增多,Jiao等(2007)應(yīng)用16S rRNA基因文庫(kù)的方法研究了秋季長(zhǎng)江口和東海陸架區(qū)的微生物多樣性,劉敏等(2008)采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)長(zhǎng)江口外低氧區(qū)的細(xì)菌群落組成進(jìn)行了分析,曾永輝(2008)和潘洛安(2005)也分別研究了長(zhǎng)江口及鄰近海域浮游細(xì)菌多樣性和分布特征,但總體由于采樣站點(diǎn)、季節(jié)、方法的差異,對(duì)該海域細(xì)菌組成及群落結(jié)構(gòu)仍然缺乏比較全面的認(rèn)識(shí)。

本文采用DAPI染色計(jì)數(shù)法對(duì)長(zhǎng)江口及鄰近海域10個(gè)站點(diǎn)表層海水中的細(xì)菌生物量進(jìn)行統(tǒng)計(jì),并結(jié)合16S rRNA基因克隆文庫(kù)法,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),研究了長(zhǎng)江口及鄰近海域細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性,為了解海洋微生物多樣性提供了分子生物學(xué)方面的基礎(chǔ)數(shù)據(jù),也為研究海洋細(xì)菌與生態(tài)系統(tǒng)之間的關(guān)系提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2014年7月,搭乘“浙?？?號(hào)”科學(xué)考察船,利用 SBE 32型采水器(海鳥(niǎo)公司),在長(zhǎng)江口及鄰近海域共采集 10個(gè)站點(diǎn)表層海水樣品,其采樣站點(diǎn)分布如圖1所示。

圖1 長(zhǎng)江口及鄰近海域采樣站點(diǎn)分布圖Fig.1 The sampling sites of the Changjiang River estuary and adjacent areas

1.1.1 DAPI樣品采集 采集表層(水面下2m)海水30mL,經(jīng)100μm的篩絹過(guò)濾后,分裝至10mL的無(wú)菌凍存管中,立即加濃度為 1%的戊二醛固定液進(jìn)行固定,黑暗固定 15分鐘后放入低溫冰箱的冷凍格(–20°C)中保存。

1.1.2 環(huán)境總DNA提取樣品采集 采集表層海水1000mL,裝于滅菌的聚乙烯塑料瓶中。樣品先用100μm的篩絹過(guò)濾,再經(jīng)孔徑為3μm和0.22μm的混合纖維素濾膜(Millipore公司)過(guò)濾,將過(guò)濾后的0.22μm濾膜放入滅菌的 5mL凍存管中,置?20°C冰箱中保存,航次結(jié)束后放置于實(shí)驗(yàn)室?80°C超低溫冰箱中長(zhǎng)期保存。

1.2 DAPI染色計(jì)數(shù)

取1—2mL待測(cè)水樣,加入終濃度為10μg/mL的DAPI染色劑,室溫下暗房染色30 min,加入含0.2μm黑色聚碳酸酯膜的過(guò)濾器,濾干后取出濾膜,放在干凈的載玻片上展平,在濾膜中間滴一滴香柏油,置于熒光顯微鏡(100倍油鏡)下觀察并隨機(jī)選擇10個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù),只計(jì)算清晰可見(jiàn)且為藍(lán)光的菌體。根據(jù)公式 BN=A×S1/(S2×V)計(jì)算每毫升細(xì)菌數(shù),其中 BN為每毫升細(xì)菌的數(shù)量,A為視野中細(xì)菌的平均數(shù),S1為濾膜的面積,S2為顯微鏡的視野面積,V為過(guò)濾水樣的體積(趙海萍等,2007)。

1.3 環(huán)境總DNA提取和16S rDNA擴(kuò)增

利用 FastPrep快速核酸提取儀(MP Biomedicals公司)和FastDNA spin kit for soil試劑盒進(jìn)行海水樣品總DNA提取,核酸蛋白檢測(cè)儀(Bio-Rad公司)測(cè)定DNA濃度和純度,純化后用于PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增采用引物 341f (5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3')和 907r(5'-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3')。50 μL 反應(yīng)體系為: 10×buffer 5 μL,dNTPs 0.5 μL,Primer 341f 1μL,Primer 907r 1 μL,H2O 41 μL,Taq 酶(TaKaRa)0.5 μL,模板DNA 1 μL。PCR擴(kuò)增條件為: 95°C預(yù)變性5 min,94°C 變性 1 min,56°C 退火 30 s,72°C 延伸 2 min,循環(huán)35次,最后72°C延伸10 min。

1.4 細(xì)菌克隆文庫(kù)構(gòu)建及序列分析

PCR回收產(chǎn)物與pMD-18T vector(TaKaRa公司)在16°C連接過(guò)夜,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司),經(jīng)藍(lán)白斑篩選,挑選陽(yáng)性克隆,重新擴(kuò)增插入片斷,將含有合適大小插入片段的克隆送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。獲得序列后,首先利用Usearch軟件(http: //drive5.com/usearch/)去除嵌合體,再應(yīng)用 BLASTn 程序搜索相似性序列,進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。采用ClustalX (Version 1.8)對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析,通過(guò)MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(Kumar et al,2004),采用Neighbor-Joining建樹(shù)方法,建樹(shù)結(jié)果進(jìn)行 Bootstrap1000次系統(tǒng)檢驗(yàn),利用PHYLIP軟件包中DNASIS程序計(jì)算距離矩陣,利用 DOTUR軟件將相似性＞97%的序列歸為一個(gè)OTU,計(jì)算多樣性指數(shù)并繪制稀釋曲線(Schloss et al,2005)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DAPI染色計(jì)數(shù)

DAPI染色計(jì)數(shù)結(jié)果如表1所示,其中B03站點(diǎn)總菌數(shù)(1.48×106cells/mL)最高,其次為 A05站點(diǎn)(1.23×106cells/mL),而 A04 站點(diǎn)的總菌數(shù)(1.16×105cells/mL)最低,10個(gè)站點(diǎn)的平均值為 4.92×105cells/mL,細(xì)菌豐度總體較高,但各站點(diǎn)之間細(xì)菌豐度也存在明顯差異,細(xì)菌豐度的高值區(qū)主要集中于舟山外海一帶,而低值區(qū)主要集中于長(zhǎng)江口區(qū)域,整體變化趨勢(shì)為從長(zhǎng)江口至外海區(qū)域細(xì)菌豐度逐漸增加。

2.2 細(xì)菌多樣性分析

2.2.1 細(xì)菌 16S rDNA 文庫(kù)分析 每個(gè)站點(diǎn)選取110個(gè)左右陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,片段長(zhǎng)度為 550—700bp;利用 DOTUR軟件,將相似性＞97%的克隆子歸為一個(gè)OTU,各站點(diǎn)的克隆文庫(kù)基本情況及多樣性指數(shù)如表2所示,細(xì)菌群落的稀釋曲線如圖2所示。

表2 長(zhǎng)江口及鄰近海域表層海水細(xì)菌多樣性指數(shù)一覽表Tab.2 Bacterial diversity indices of the surface seawater in Changjiang River estuary and adjacent areas

Chao1和ACE指數(shù)用于計(jì)算群落的物種豐富度,在不同算法的計(jì)算下它們有著相同的變化趨勢(shì)。由表2可知,豐富度指數(shù)Chao 1與ACE指數(shù)同時(shí)顯示A02站點(diǎn)擁有最高豐富度,C03站點(diǎn)次之,豐富度最低的為C04站點(diǎn)。Shannon和Simposon指數(shù)用于計(jì)算群落的多樣性,由于計(jì)算方法的差異它們?cè)跀?shù)值上的變化趨勢(shì)是相反的,但兩者均顯示 A02站點(diǎn)細(xì)菌多樣性最高,C03站點(diǎn)次之,C04站點(diǎn)最低。結(jié)合各站點(diǎn)的群落豐富度和多樣性指數(shù),可以看出 A02站點(diǎn)的細(xì)菌群落多樣性最高。由稀釋性曲線可知,A02和C03站點(diǎn)的稀釋曲線仍然有上升的趨勢(shì),表明該站點(diǎn)中細(xì)菌群落多樣性很高,克隆子數(shù)量還未完全覆蓋其多樣性,這與其豐富度和多樣性指數(shù)結(jié)果是一致的,其余站點(diǎn)的稀釋性曲線均趨于平穩(wěn),基本上能反映真實(shí)環(huán)境中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)情況。

2.2.2 細(xì)菌克隆文庫(kù)物種類(lèi)群分析 通過(guò)BLASTn搜索相似序列,可將10個(gè)站點(diǎn)共1041個(gè)克隆子分為 11個(gè)細(xì)菌門(mén)類(lèi),分別為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)(Cyanobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)、纖維桿菌門(mén)(Fibrobacteres)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)和柔膜菌門(mén)(Tenericutes),另有 2.02%的細(xì)菌分類(lèi)地位不確定。變形菌門(mén)又分為 α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)和ε-變形菌綱(Epsilonproteobacteria)五個(gè)綱。各細(xì)菌類(lèi)群在每個(gè)站點(diǎn)克隆文庫(kù)中的比例如圖3所示。

圖2 十個(gè)文庫(kù)的稀釋性曲線Fig.2 The rarefaction curve of the 10 clone libraries

圖3 細(xì)菌類(lèi)群在不同采樣點(diǎn)克隆文庫(kù)中的比例Fig.3 The ratios of bacterial groups in clone library of different sites

綜合 10個(gè)站點(diǎn)文庫(kù)的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),變形菌門(mén)為研究區(qū)域中最大的優(yōu)勢(shì)菌群(占 60.61%),其中 α-變形菌占 50.62%,β-變形菌占 4.32%,γ-變形菌占4.13%,δ-變形菌占 1.44%,ε-變形菌占 0.10%;僅次于變形菌門(mén)的是擬桿菌門(mén)(占15.18%);第三大優(yōu)勢(shì)菌群為放線菌門(mén)(占14.79%)。

對(duì)各站點(diǎn)文庫(kù)進(jìn)行比較分析,可見(jiàn)除 B03站點(diǎn)外,變形菌門(mén)是其余 9個(gè)站點(diǎn)文庫(kù)的主要優(yōu)勢(shì)類(lèi)群,其中C04站點(diǎn)文庫(kù)比例最高(占90.66%),變形菌門(mén)中又以 α-變形菌為主要類(lèi)群,其余類(lèi)群(特別是 δ-變形菌和ε-變形菌)所占比例相對(duì)較少,ε-變形菌僅在A02站點(diǎn)有發(fā)現(xiàn)且含量很低(僅占 0.93%)。作為第二大優(yōu)勢(shì)類(lèi)群的擬桿菌,僅在B03站點(diǎn)克隆文庫(kù)中的含量超過(guò)變形菌門(mén)(占43.16%),成為該站點(diǎn)文庫(kù)的主要類(lèi)群,其它站點(diǎn)均低于變形菌門(mén)。放線菌門(mén)在10個(gè)站點(diǎn)克隆文庫(kù)中均有分布,其中 A02站點(diǎn)放線菌含量最高(占35.51%),與該站點(diǎn)的變形菌門(mén)含量相當(dāng)。

除了A01站點(diǎn)未見(jiàn)相應(yīng)克隆,藍(lán)細(xì)菌門(mén)在各文庫(kù)的分布比較均勻,但含量不高,最高值出現(xiàn)在 C05站點(diǎn)(占12.26%)。浮霉菌門(mén)只在A02和C03站點(diǎn)文庫(kù)中有分布,并且含量極低(分別為0.93%和0.92%)?？拷L(zhǎng)江口的A01和A02站點(diǎn)文庫(kù)含有其它站點(diǎn)沒(méi)有的厚壁菌門(mén),其含量分別占各自文庫(kù)的8.16%和3.74%。綠彎菌門(mén)主要分布于A斷面(A01、A02、A03和A04站點(diǎn)),其中 A02文庫(kù)中綠彎菌門(mén)含量最高(占 3.74%)。柔膜菌門(mén)僅出現(xiàn)在 C05站點(diǎn)文庫(kù)中,且僅占 0.94%。A04站點(diǎn)文庫(kù)含有其它站點(diǎn)文庫(kù)沒(méi)有的纖維桿菌門(mén)(占1.98%)。酸桿菌門(mén)和疣微菌門(mén)只在 A02站點(diǎn)的克隆文庫(kù)中出現(xiàn),含量分別為2.80%和1.87%。同時(shí)分類(lèi)地位不確定的類(lèi)群在各站點(diǎn)文庫(kù)中都有極少量的分布。

2.3 細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3.1 變形菌門(mén)系統(tǒng)發(fā)育分析 使用MEGA5.0軟件,對(duì)各站點(diǎn)典型變形菌序列與BLASTn比對(duì)相似序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4),克隆子相似菌株分離源的分析結(jié)果如表3所示。

由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和相似序列生境分析結(jié)果可知,α-變形菌綱克隆子的相似序列主要來(lái)自表層海水、富營(yíng)養(yǎng)化淡水水域,個(gè)別源自深海熱液口;β-變形菌綱克隆子的相似序列主要來(lái)自淡水湖泊和海水環(huán)境;γ-變形菌綱克隆子的相似序列主要來(lái)自表層水體、海洋沉積物和土壤環(huán)境;δ-變形菌綱克隆子相似序列的分離源主要是墨西哥灣石油泄漏海區(qū)和西班牙海域碳?xì)浠衔镂廴镜某练e物,推測(cè)該菌可能與石油烴污染環(huán)境相關(guān);ε-變形菌則在水體環(huán)境中分布較少,唯一的基因型A02B21與湖泊沉積物中的ε-變形菌同源性達(dá)99%。SAR類(lèi)群是海洋中比較典型的細(xì)菌類(lèi)群,也是影響海洋碳循環(huán)的重要因素,由圖表可知,SAR11的相似菌株來(lái)自美國(guó)普吉特海灣表層海水和墨西哥灣石油污染海域;SAR406的分離源則分別來(lái)自沿海表層和深海的海水環(huán)境,說(shuō)明該類(lèi)群細(xì)菌對(duì)于壓力、光照等環(huán)境具有很強(qiáng)的適應(yīng)性。

圖4 根據(jù)細(xì)菌16S rDNA基因序列構(gòu)建的變形菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 The phylogenetic tree of Proteobacteria according to 16S rDNA gene sequences

2.3.2 其它細(xì)菌類(lèi)群系統(tǒng)發(fā)育分析 除變形菌門(mén)外,各站點(diǎn)其它典型細(xì)菌序列與BLASTn比對(duì)相似序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖5所示,克隆子相似菌株分離源的分析結(jié)果見(jiàn)表4。

由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果可知,變形菌門(mén)以外的其它代表性細(xì)菌克隆,其相似序列大多來(lái)自海水環(huán)境,少數(shù)來(lái)源于沉積物和淡水環(huán)境。其中擬桿菌門(mén)(黃桿菌綱)克隆子的相似序列主要來(lái)自于河口和海灣等生境;放線菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、厚壁菌門(mén)等細(xì)菌克隆子的相似菌株則大多來(lái)源于受芳香烴、石油、多環(huán)芳烴等污染的海域、土壤或沉積物;酸桿菌門(mén)克隆子的相似序列來(lái)自太湖東北部爆發(fā)微囊藻水華的水樣;疣微菌門(mén)的相似序列則來(lái)自夏威夷群島沿岸海水;藍(lán)細(xì)菌門(mén)克隆子相似序列的分布比較廣泛,主要來(lái)自各海域的表層海水;浮霉菌門(mén)克隆子相似序列的生境來(lái)自西南太平洋勞盆地深海熱液區(qū)沉積物;另外分布較少的纖維桿菌門(mén)和柔膜菌門(mén),其克隆子相似序列分別來(lái)自瑞典爆發(fā)水華的淡水湖泊和美國(guó)佐治亞州Sapelo島沿岸表層海水。在分類(lèi)地位不明確的細(xì)菌中,基因型B02B83(1個(gè)克隆子)、C03B1(4個(gè)克隆子)、和C04B90(1個(gè)克隆子)在發(fā)育樹(shù)中處于同一個(gè)單獨(dú)的分支,其相似序列主要來(lái)自我國(guó)南海近岸表層海水、阿根廷Espejo湖水以及廣東湛江灣海水。

表3 變形菌克隆子序列比對(duì)及相似菌株分離源分析Tab.3 The taxonomic affiliation of Proteobacteria and the closest species origins

3 討論

3.1 長(zhǎng)江口及鄰近海域表層海水細(xì)菌豐度

從長(zhǎng)江口到舟山外海的區(qū)域是受人類(lèi)活動(dòng)影響最大的區(qū)域,每年有著大量的陸源有機(jī)物質(zhì)輸入,而該區(qū)域又是臺(tái)灣暖流和長(zhǎng)江沖淡水交匯的區(qū)域(唐曉暉等,2004),復(fù)雜的水文地理?xiàng)l件使得該區(qū)域的細(xì)菌豐度同時(shí)受眾多環(huán)境因素的影響。趙三軍等(2003)研究發(fā)現(xiàn)秋季長(zhǎng)江口外海域表層海水的細(xì)菌豐度為3.97×105—1.162×106cells/mL 之間,平均值為 7.19×105cells/mL;劉晶晶等(2011)調(diào)查了夏季長(zhǎng)江口及鄰近海域浮游細(xì)菌的數(shù)量,結(jié)果為 6.92×105—5.54×106cells/mL之間;王新等(2010)對(duì)春季東海赤潮高發(fā)區(qū)的浮游細(xì)菌豐度調(diào)查結(jié)果為 5.85×104—9.26×105cells/mL之間;上述研究結(jié)果與本次調(diào)查結(jié)果(細(xì)菌豐度在 1.16×105—1.48×106cells/mL 之間,平均值為 4.92×105cells/mL)都有一定差異,原因主要可能是采樣季節(jié)不同以及環(huán)境特征的改變。

圖5 根據(jù)細(xì)菌16S rDNA基因序列構(gòu)建的其它分支細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 The phylogenetic tree of other bacteria according to 16S rDNA gene sequences

就細(xì)菌豐度的空間變化而言,本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌豐度分別在A05、B03、C05等靠近外海的站點(diǎn)形成高值區(qū),在相對(duì)離岸較近的 A01—A04和 C03—C04站點(diǎn)海域形成低值區(qū),細(xì)菌豐度的總體空間變化趨勢(shì)是外海較近岸高,其主要原因可能是外海區(qū)域的幾個(gè)站點(diǎn)位于營(yíng)養(yǎng)鹽豐富、光照充足的高生產(chǎn)力海域,浮游植物的繁盛促進(jìn)了細(xì)菌的大量生長(zhǎng);相反,在長(zhǎng)江口近岸海域,由于水團(tuán)之間混合所產(chǎn)生的高濁度和低透光率影響了浮游植物生長(zhǎng),從而形成海洋細(xì)菌低密度區(qū)。季倩(2008)研究認(rèn)為長(zhǎng)江口靠近最大混濁帶異養(yǎng)細(xì)菌豐度較低,由長(zhǎng)江口向外海其豐度顯著增加;寧修仁等(2004)也認(rèn)為在長(zhǎng)江口及鄰近區(qū)域的沖淡水區(qū)中部以及沖淡水和海水交匯處是低細(xì)菌豐度和活性區(qū)域,上述報(bào)道與本次的研究結(jié)果基本一致。本次研究中B02站點(diǎn)雖然處在A03和C03站點(diǎn)相近經(jīng)度區(qū)域,但細(xì)菌生物量處于較高水平,原因可能是 B02站點(diǎn)位于擁有大量天然海藻場(chǎng)和人工貽貝養(yǎng)殖場(chǎng)的枸杞島海域,養(yǎng)殖區(qū)域的存在對(duì)細(xì)菌豐度的影響較大,有研究表明浮游植物和海藻光合作用產(chǎn)物以及部分海藻降解產(chǎn)生的腐殖質(zhì)促進(jìn)了浮游細(xì)菌的新陳代謝(V?r?s et al,2003),同時(shí)貝類(lèi)養(yǎng)殖的殘餌、糞便所分解的有機(jī)質(zhì)含量較高,在該海域獨(dú)特的水文地理?xiàng)l件下可能導(dǎo)致水體中細(xì)菌豐度偏高。

表4 其它細(xì)菌克隆子序列比對(duì)及相似菌株分離源分析Tab.4 The taxonomic affiliation of other bacteria and the closest species origins

3.2 長(zhǎng)江口及鄰近海域細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外有許多針對(duì)長(zhǎng)江口海域表層海水細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究,如李和陽(yáng)等(2012)研究了長(zhǎng)江口典型站位浮游細(xì)菌類(lèi)群的組成特征,結(jié)果表明變形菌門(mén)(α-,β-和 γ-變形菌綱)為該海域優(yōu)勢(shì)菌群;Feng等(2009)對(duì)長(zhǎng)江口及鄰近海域海水和沉積物樣品進(jìn)行較全面的研究,結(jié)果顯示變形菌門(mén)是該海洋環(huán)境中含量最豐富的種類(lèi)(占克隆數(shù)的72.9%),其中α-變形菌綱和γ-變形菌綱為該海域海水中的最大優(yōu)勢(shì)菌群;Sekiguchi等(2002)分析了長(zhǎng)江口特定站位細(xì)菌的遺傳多樣性,發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌為 α-變形菌和γ-變形菌。從以上研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)變形菌門(mén)是長(zhǎng)江口及鄰近海域表層海水中的優(yōu)勢(shì)菌群,作者在本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到變形菌門(mén)含量達(dá)到總克隆數(shù)的60.61%,是本次研究海域表層海水中的最大優(yōu)勢(shì)類(lèi)群,這與以往研究結(jié)果基本一致。變形菌門(mén)作為本實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群,在長(zhǎng)江口及鄰近海域生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用,尤其是含量豐富、分布廣泛的α-變形菌綱(占總克隆數(shù)的50.62%)。目前對(duì)α-變形菌的研究發(fā)現(xiàn),其在低價(jià)硫化物的轉(zhuǎn)化過(guò)程中起間接作用,常以H2S作為代謝中的電子供體(李濤等,2008);多數(shù)α-變形菌還具有廣泛的耐鹽性,并且利用 DOC等碳源的能力很強(qiáng)(Sj?stedt et al,2012)。本實(shí)驗(yàn)中有5個(gè)站點(diǎn)的 α-變形菌含量高達(dá) 50%以上,說(shuō)明相應(yīng)環(huán)境特征非常適合該細(xì)菌類(lèi)群的生長(zhǎng),同時(shí)也驗(yàn)證了從長(zhǎng)江口到外海區(qū)域鹽度和營(yíng)養(yǎng)鹽急劇變化條件下 α-變形菌仍為本次研究海域的優(yōu)勢(shì)菌群。β-變形菌是世界范圍內(nèi)淡水湖泊和河口區(qū)域的優(yōu)勢(shì)菌群(Mueller-Spitz et al,2009;Cottrell et al,2005),但本次研究中β-變形菌含量?jī)H占總文庫(kù)的4.32%,這可能與長(zhǎng)江口沖淡水的影響有關(guān)。γ-變形菌是海水和沉積物環(huán)境中的常見(jiàn)細(xì)菌類(lèi)群,與光能營(yíng)養(yǎng)、趨堿性、氨氧化和硫降解等過(guò)程相關(guān)(Bowman et al,2005;Ravenschlag et al,1999),目前較多報(bào)道顯示γ-變形菌在沉積物環(huán)境中屬于優(yōu)勢(shì)類(lèi)群(Bowman et al,2003;Inagaki et al,2003),但在海水環(huán)境中不是優(yōu)勢(shì)菌群,我們的研究結(jié)果也驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。δ-變形菌常在硫循環(huán)以及鐵等金屬的代謝中扮演重要角色(Xu et al,2008),本次研究發(fā)現(xiàn) δ-變形菌克隆與原油泄漏海域的脫硫桿菌相似度高,脫硫桿菌是一種能降解有機(jī)物(尤其是石油烴類(lèi))的硫酸鹽還原細(xì)菌(Musat et al,2009),這預(yù)示著 δ-變形菌含量豐富的站點(diǎn)可能受到石油烴的污染。ε-變形菌雖然能廣泛利用環(huán)境中的氫、硫化物、硝酸鹽、氧氣等多種物質(zhì)作為電子受體或供體(Takai et al,2003;Nakagawa et al,2005),但在海水中的分布極少,本次調(diào)查也僅在A02站點(diǎn)有發(fā)現(xiàn)。

擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)和藍(lán)細(xì)菌門(mén)是本次研究分布比較廣并且比例也較高的類(lèi)群。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的擬桿菌主要包括黃桿菌綱和鞘脂桿菌綱兩大類(lèi),其中黃桿菌綱與藻類(lèi)的赤潮和降解過(guò)程有關(guān)(Abell et al,2005),而鞘脂桿菌綱重要類(lèi)群為噬胞菌屬(Cytophaga)可以降解纖維素(Li et al,2011),上述擬桿菌門(mén)含量較高與該海域初級(jí)生產(chǎn)力水平有關(guān)。放線菌是一類(lèi)在海洋中廣泛存在且豐度較高的類(lèi)群,有研究表明放線菌在有機(jī)污染物的降解過(guò)程當(dāng)中起著非常重要的作用(李和陽(yáng)等,2012),同時(shí)被普遍認(rèn)為是生物活性物質(zhì)和海洋藥物開(kāi)發(fā)的重要微生物來(lái)源(Bull et al,2005),這表明長(zhǎng)江口及鄰近海域可能蘊(yùn)藏著豐富的放線菌及相關(guān)生物活性產(chǎn)物資源。藍(lán)細(xì)菌是廣泛分布于海洋中能進(jìn)行放氧光合作用的超微型浮游植物(孫晟等,2003),是海洋初級(jí)生產(chǎn)力和微食物網(wǎng)中重要的組成成分。而在本次調(diào)查中,多個(gè)站點(diǎn)均發(fā)現(xiàn)藍(lán)細(xì)菌且其數(shù)量不少,可以看出藍(lán)細(xì)菌對(duì)該海域生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性與多樣性有重要意義。

作者在實(shí)驗(yàn)中有發(fā)現(xiàn)一些分布范圍和比例都較小的類(lèi)群,包括厚壁菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、疣微菌門(mén)和纖維桿菌門(mén)。厚壁菌門(mén)中的芽孢桿菌主要存在于A01和A02站點(diǎn),Vieira等(2008)指出厚壁菌豐富的地方可能表明附近海區(qū)的污染,這可能與A01和A02兩個(gè)站點(diǎn)處在近河口位置有關(guān)。綠彎菌是除變形菌和硝化螺旋菌外,第三類(lèi)能通過(guò)硝酸鹽的氧化而獲得能量的一類(lèi)細(xì)菌(Sorokin et al,2012),作者發(fā)現(xiàn)綠彎菌僅存在于近海區(qū)域受陸源輸入影響而營(yíng)養(yǎng)鹽豐富的幾個(gè)站點(diǎn)當(dāng)中,因此推測(cè)綠彎菌傾向于生活在營(yíng)養(yǎng)鹽豐富的海域中。酸桿菌一般由外界環(huán)境所引入,A02站點(diǎn)位于長(zhǎng)江口受地表徑流影響較大,檢測(cè)到的酸桿菌很可能為陸源菌,另外Barns等(2007)曾報(bào)道過(guò)酸桿菌門(mén)類(lèi)群多存在于重金屬污染等酸性較強(qiáng)的環(huán)境中,這說(shuō)明長(zhǎng)江口區(qū)域可能存在一定程度酸化的傾向。浮霉菌門(mén)細(xì)菌屬于兼性厭氧細(xì)菌,并且這類(lèi)細(xì)菌可能與深海有機(jī)質(zhì)的礦化有關(guān)(S?rensen et al,2005),本研究結(jié)果顯示浮霉菌的相似序列來(lái)源于深海熱液區(qū)。

3.3 長(zhǎng)江口及鄰近海域特殊細(xì)菌類(lèi)群及分布

本次實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)了以往同海域研究中鮮有報(bào)道的柔膜菌門(mén)和SAR類(lèi)群。目前關(guān)于柔膜菌門(mén)的報(bào)道并不多,僅侯梅鋒等(2011)在青海湖底泥中有發(fā)現(xiàn),主要是一類(lèi)耐鹽菌,另有Beazley等(2012)在墨西哥灣原油泄漏的海岸鹽沼中發(fā)現(xiàn)大量柔膜菌的存在。本次研究在 C05站點(diǎn)發(fā)現(xiàn)少量的柔膜菌門(mén),具體原因不詳。SAR11是最早發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)廣泛分布于亞熱帶海域的浮游細(xì)菌類(lèi)群,研究表明SAR11細(xì)菌能夠調(diào)控海洋中相當(dāng)數(shù)量DOM的流通,在C、N等元素的循環(huán)中起著重要的作用(Rappé et al,2002),另外海洋細(xì)菌生理代謝機(jī)制研究方面的重要發(fā)現(xiàn)之一是 SAR11菌群需要外源還原態(tài)硫來(lái)維持生長(zhǎng)(Tripp et al,2008)。對(duì)SAR406類(lèi)群的研究顯示,它是海洋最低含氧帶(Oxygen Minimum Zone,OMZ)中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群(Wright et al,2012),可能與缺氧環(huán)境有關(guān);Crump等(2007)在切薩皮克灣缺氧底層水中發(fā)現(xiàn)高豐度的 SAR406類(lèi)群,類(lèi)似于 OMZ的細(xì)菌群落構(gòu)成。本次研究發(fā)現(xiàn) A02站點(diǎn)同時(shí)有SAR11和SAR406類(lèi)群的分布,可能與該站點(diǎn)恰好位于長(zhǎng)江口外缺氧區(qū),有機(jī)質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)鹽含量豐富有關(guān)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)DAPI染色計(jì)數(shù)和構(gòu)建16S rRNA基因文庫(kù)的方法對(duì)長(zhǎng)江口及鄰近海域10個(gè)站點(diǎn)表層海水中細(xì)菌的生物量及多樣性進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)江口及鄰近海域表層海水中細(xì)菌的豐度總體較高,但各站點(diǎn)間存在一定差異。海水中細(xì)菌類(lèi)群主要包括變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、纖維桿菌門(mén)、疣微菌門(mén)和柔膜菌門(mén)等 11個(gè)類(lèi)群,其中 α-變形菌綱所占比例最高,其次為擬桿菌門(mén)和放線菌門(mén),其它類(lèi)群的分布比例和范圍都較小,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了廣受關(guān)注的SAR類(lèi)群和海洋環(huán)境中少見(jiàn)的柔膜菌門(mén)。研究表明某些細(xì)菌類(lèi)群可能成為該海域生態(tài)系統(tǒng)受污染的指示生物,此外未確定分類(lèi)地位的細(xì)菌可能是一些未被發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌種類(lèi),有待進(jìn)一步調(diào)查研究。以上結(jié)果充分說(shuō)明了長(zhǎng)江口及鄰近海域表層海水細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有豐富的多樣性和復(fù)雜性。

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