◎肖 雪 許歆瑤 李 潔

(華東理工大學(xué) 藥學(xué)院，上海 201424)

酪氨酸酶（EC1.14.18.1）是一種含銅的金屬酶，普遍存在于植物，動(dòng)物，真菌和細(xì)菌中。酪氨酸酶具有單酚加羥酶和二酚氧化酶的活性，其催化反應(yīng)過程：首先催化單酚為二酚，再將二酚催化為醌類化合物，醌類在無酶條件下聚合為黑色素類。酪氨酸酶是目前已知的生物體中唯一參與黑色素合成的關(guān)鍵酶[1]，抑制酪氨酸酶的活性，可改善皮膚色素細(xì)胞中酪氨酸酶的代謝，阻止色素沉著，達(dá)到美白效果。目前應(yīng)用的化學(xué)合成的酪氨酸酶抑制劑的安全性較差，而天然植物提取物具有無毒，安全等特點(diǎn)。因此植物提取物抑制酪氨酸酶研究越來越受到國(guó)內(nèi)外的關(guān)注，也具有較大的市場(chǎng)潛力。本文對(duì)近些年研究的植物提取物進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

1 植物提取物分類

1.1 黃酮類及其衍生物

黃酮類化合物是自然界中廣泛存在的一類化合物，常以游離態(tài)或與糖結(jié)合成苷的形式存在于幾乎每種植物體內(nèi)。黃酮類化合物是兩個(gè)苯環(huán)（A環(huán)和B環(huán)）中間通過三碳鏈互相連接而成的一系列化合物，黃酮體可以分為黃酮類，黃酮醇類，二氫黃酮類，二氫黃酮醇類，異黃酮類，二氫異黃酮類，查耳酮類，二氫查耳酮類，花色素類等。A,B環(huán)上常見的取代基有羥基，甲氧基，異戊烯基等，組成苷的糖常見的有D-葡萄糖，L-鼠李糖，D-葡萄糖醛酸等。

N.Saewan[2]等人用乙酸乙酯提取Blumea balsamifera葉子，用硅膠柱層析法分離出二氫黃酮醇和二氫槲皮素-4'-甲基乙醚，二氫槲皮素-7,4'-二甲基乙醚，rhamnetin（鼠李素），tamarixetin（怪柳黃素）皆對(duì)酪氨酸酶的抑制作用強(qiáng)于熊果苷，其抑制機(jī)制均為競(jìng)爭(zhēng)型抑制。Flemingia philippinensis roots[3]（蔓性千斤拔）用95%甲醇溶液提取獲得最佳抑制效果（30μg/ml時(shí)抑制率為80%）的提取比例，用硅膠柱層析法分離出六種對(duì)酪氨酸酶有抑制作用的物質(zhì)，三種是我們熟知的千斤拔素D,lupinifolin，khonklonginol H，另三種筆者命名為千斤拔素A、B、C，其中千斤拔素C最為有效，IC50值為1.28μM，是競(jìng)爭(zhēng)型抑制。采用95%乙醇提取Morus nigra[4]的根，提取物用硅膠柱層析法分離出9種對(duì)酪氨酸酶抑制作用強(qiáng)于曲酸的物質(zhì)，其中2,4,2',4'-tetrahydroxychalcone，morachalcone A效果最好，IC50為0.062和0.14μM。通過HPLC研究其分子構(gòu)型，為后期研究構(gòu)效關(guān)系提供了數(shù)據(jù)。Salleh[5]等人研究了馬來西亞十種胡椒屬植物，用乙酸乙酯提取，其中P.porphyrophyllum的提取物對(duì)蘑菇酪氨酸酶抑制作用最好，其主要成分為黃酮類，Salleh等人對(duì)P.porphyrophyllum的提取方式進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)其甲醇提取物對(duì)蘑菇酪氨酸酶抑制效果最好，抑制率為98%±0.3。在提取甘草酸后的甘草廢渣[6]中發(fā)現(xiàn)了可抑制酪氨酸酶的有效物質(zhì)—異甘草素和光甘草定。異甘草素為單酚抑制酶，IC50為1.66mmol·L-1；光甘草定對(duì)單酚酶和二酚酶均有抑制作用，IC50 分別為 31.16μmol·L-1，20.38μmol·L-1，其作用機(jī)制為競(jìng)爭(zhēng)型抑制。

1.2 苷類

苷類，又稱配糖苷，是糖或糖的衍生物與另一非糖物質(zhì)通過糖的端基碳原子連接而成的化合物。

Huang[7]等人采取不同比例的乙醇溶液從crataegus pinnatifida種子提取的糖苷7R,8S-二氫脫氫二松柏醇-9-O-β-D-葡萄糖苷和7R,8S-二氫脫氫二松伯醇-9'-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)酪氨酸酶有明顯的抑制效果，抑制率分別為58.15%和46.00%，乙醇溶液最佳比例為70%。Chang[8]等人以番茄萃取物為材料，得到其IC50為2.46mg/mL,通過Superdex peptide HR膠體管柱層析推測(cè)該抑制劑可能為糖苷類化合物。從紅洋蔥中提取的槲皮素4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷表現(xiàn)出較強(qiáng)的酪氨酸酶抑制作用，IC50值為 4.3μmol·L-1[9]。

1.3 醌類

醌是含有共軛環(huán)己二烯二酮或環(huán)己二烯二亞甲基結(jié)構(gòu)的一類有機(jī)化合物的總稱。采用甲醇溶液回流提取Anastatica hierochuntica[10]，HPLC分離的丹參酮（菲醌類），異丹參酮A和異丹參酮B可影響酪氨酸酶的mRMA表達(dá)，尤其是對(duì)TRP-2有較強(qiáng)的抑制作用，IC50在6.1—32μM之間。

1.4 苯丙素酚類

凡有一個(gè)或幾個(gè)C6-C3單位構(gòu)成，苯核上有酚羥基或烷氧基取代的天然芳香族成分都?xì)w為苯丙素酚類，包括苯丙烯，苯丙醇，苯丙酸及其縮酯，香豆素，黃酮類，木脂素和本質(zhì)素類等。從白芷[18]，杜鵑花[19]，蘆薈[20]中都分離出了香豆素的衍生物，均對(duì)酪氨酸酶有抑制作用。

1.5 萜類

萜類化合物是一類天然烴類化合物，由兩個(gè)或兩個(gè)以上異戊二烯分子聚合衍生而成。萜類化合物廣泛存在于自然界，是構(gòu)成某些植物的香精，樹脂，色素等的主要成分，如玫瑰油，松脂等。從白術(shù)[21]中分離出了倍半萜化合物selina-4（14）,7（11）-dien-8-one，該化合物可以使黑色素細(xì)胞合成相關(guān)酶的表達(dá)量減少。

1.6 生物堿

生物堿是存在于生物界的一類含氮有機(jī)化合物，多數(shù)具有復(fù)雜的氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)、堿性和顯著的生物活性。一般按生物堿化學(xué)結(jié)構(gòu)的基本母核進(jìn)行分類，例如吡啶類生物堿-苦參堿，異喹啉類生物堿-青藤堿，甾類生物堿-藜蘆堿等。

Hui-Min Wang[11]等人用甲醇從Michelia alba提取的（-）-N-formylanonaine對(duì)蘑菇酪氨酸酶有抑制作用，IC50為 74.3μM。

2 評(píng)價(jià)方法

2.1 分光光度法

以L-酪氨酸或L-多巴作底物，以熊果苷或曲酸或維生素C做陽性對(duì)照，測(cè)定吸光度A，計(jì)算其半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration,IC50）。

2.2 光譜法

常用的光譜法包括紫外光譜分析，熒光光譜法，圓二色譜法。閆家凱[12]等人采用光譜法對(duì)夏枯草黃酮進(jìn)行了研究，通過紫外光譜分析可知其為黃烷酮和雙氫黃酮醇類化合物，熒光光譜顯示夏枯草黃酮能顯著的增強(qiáng)酪氨酸酶的疏水性，圓二色譜分析表明夏枯草黃酮誘導(dǎo)酪氨酸酶的構(gòu)象發(fā)生了部分變化。

3 復(fù)方

Chun Liang等[13]將Silmax（菝葜）的甲醇提取物分別溶于己烷，乙酸乙酯和水中，其中乙酸乙酯提取物對(duì)酪氨酸酶抑制效果最好，由HPLC,C-NMR得到的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)顯示提取物中氧化白藜蘆醇效果優(yōu)于薯蕷皂苷，其以酪氨酸酶和L-多巴為底物的陽性對(duì)照，IC50分別為7.8，10.9μg/mL，但兩者的混合物可以達(dá)到更好的效果，混合物的IC50分別減小為5.1，5.7μg/mL。劉暢等[14]測(cè)定了20種植物醇提物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率。4種抑制效果好的植物分別為桑白皮、甘草、芙蓉花和牡丹花，并將4種抑制效果好的植物按不同配比進(jìn)行組合，當(dāng)配比為牡丹花3g，甘草2g，桑白皮3g和芙蓉花2g的組合醇提物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率可達(dá)93.04%。我國(guó)的中藥方劑超過9萬，其中不乏美白的方劑，對(duì)于已有的美白方劑研究也是十分有價(jià)值的，尤卓瑩等[15]人通過均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，分析得常規(guī)水提法所得的四物湯達(dá)到最佳美白作用的各成分質(zhì)量比為m（當(dāng)歸）：m（川芎）：m（白芍）：m（熟地）=85：66：10：199。而通過逐步回歸分析可知，四物湯在抑制酪氨酸酶的實(shí)驗(yàn)中存在交互作用，不應(yīng)把四物湯中各味藥分開提取研究其美白功效。

4 影響因素

通過對(duì)多數(shù)文獻(xiàn)總結(jié)可知，多數(shù)提取物對(duì)酪氨酸酶抑制作用具有濃度相關(guān)性，因此會(huì)改變提取物濃度的提取因素均為影響提取物對(duì)酪氨酸酶抑制作用的因素，其中提取時(shí)間，提取的料液比，提取溫度為主要限制因素。另外在分光光度法測(cè)定抑制率時(shí)，pH值也是影響因素之一。提取時(shí)還可以用超聲波，提取液氮?dú)饧訅撼^濾等方法輔助。在對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，可選擇三因素三水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

5 研究方向討論

酪氨酸酶抑制劑與皮膚美白、色素沉著等美容需求密切相關(guān)。因化學(xué)物的不安全因素，從植物中尋找酪氨酸酶抑制劑成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。然而大自然給予我們的是千奇百怪的天然植物，如何更好地發(fā)現(xiàn)并安全有效的利用天然產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)是我們研究的重點(diǎn)。我們認(rèn)為酪氨酸酶抑制劑以后的研究方向更多的走向多種植物提取物的配伍，一是對(duì)于酪氨酸單酚酶和酪氨酸二酚酶的復(fù)合抑制，二是不同抑制機(jī)制的交互，三是不同植物提取物之間的協(xié)同作用。根據(jù)已知植物的有效成分可以進(jìn)行篩選，例如，眾所周知，多酚物質(zhì)是一類重要的酪氨酸酶抑制劑，可通過清除活性氧、絡(luò)合Cu2+和與底物競(jìng)爭(zhēng)來發(fā)揮其抑制活性[16]，那么我們?cè)诤Y選時(shí)應(yīng)當(dāng)注重含多酚的植物。對(duì)于未知有效成分植物的發(fā)現(xiàn)，更好地辦法是建立有效的篩選機(jī)制，如劉艷杰等[17]的基于譜效-構(gòu)效關(guān)系篩選大黃中酪氨酸酶活性抑制成分，由此我們可以試著建立類似先導(dǎo)化合物篩選的體系，利用計(jì)算機(jī)輔助藥物分子對(duì)接評(píng)價(jià)，進(jìn)行更加便捷的發(fā)現(xiàn)新的具有酪氨酸酶抑制作用的植物。這一課題符合綠色化學(xué)的理念，有巨大的市場(chǎng)前景，是值得研究的。

[1]Baurin N,Arnoult E,Scior T,etal.Preliminary Screening of some tropical plants for anti-tyrosinase activity[J].J.Ethaopharmacol.2002,82:155-158.

[2]N.Saewan,S.Koysomboon,K.Chantrapromma.Anti-tyrosinase and anti-cancer activities offlavonoids from Blumea balsamifera DC[J].Journal of Medicinal Plants Research2011,5(6):1018-1025.

[3]Yan Wang,Marcus J.Curtis-Long,Byong Won Lee,etal.Inhibition of tyrosinase activity by polyphenol compounds from flemingia philippinensis roots[J].Bioorganic&Medicinal Chemistry,2014,22(3).

[4]Zong-Ping Zheng,Ka-Wing Cheng,Qin Zhu,etal.Tyrosinase Inhibitory Constituents from the Roots of Morus nigra:A Struture-Activity Relationship Study[J].Agric Food Chem,2010,58(9):5368-5373.

[5]Salleh WM,Hashim MA,Ahmad F,Heng Yen K.Anticholinesterase and antitryosinase activities of ten piper species from Malaysia[J].Advanced Pharmaceutical Bulletin,2014,4（2）:527-31.

[6]范玉涵，馬全武，王建國(guó)，等.甘草廢渣中有效成分對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24（11）：2649-2652.

[7]Xiao-Xiao Huang,Qing-Bo Liu,et al.Antioxidant and Tyrosinase Inhibitory Effects of Neolignan Glycosides from Crataegus pinnatifida Seeds[J].Planta Med,2014，80（18）：1732-1739.

[8]Lee-Wen Chang,Li-Chen Chang,Chit-Kwang Chiu,etal.Characterization of extract of Lycopersicon esculentum Mill.with anti-tyrosinse activity[J].Chia-nan AnnualBulletin,2010(36):79-86.

[9]Arung ET,Wijaya Kusuma I,Shimizu K,et al.Tyrosinase inhibitory effect of quercetion 4’-O-β-D-glucopyranoside from dried skin of red onion(Allium cepa)[J].Nat Prod Res,2011,25(3):256-263.

[10]Souichi Nakashima,Hisashi Matsuda,Yoshimi Oda,etal.Melanogenesis inhibitors from the desert plant Anastatica hierochuntica in B16 melanoma cell[J].Bioorganic&MedicinalChemistry.2010,18(6).

[11]Hui-Min Wang,Chung-Yi Chen,Chun-Yen Chen,etal.（-）-N-Formylanonaine from Michelia alba as a human tyrosinase inhibitor and antioxidant[J].Bioorganic&MedicinalChemistry,2010,18(74).

[12]閆家凱，張國(guó)文，周佳.光譜法研究夏枯草黃酮對(duì)酪氨酸酶的抑制作用[J].分析實(shí)驗(yàn)室,2013,32(2):17-21.

[13]Chun Liang,Ju-Hwan Lim,Seung-Hyung Kim,etal.Dioscin:A Synerg;tryosinase inhibitor from the roots of smilax china[J].Food chemistry,2012,134(12):1146-1148.

[14]劉暢，莫思穎，張怡，等.20種植物醇提物美白作用的體外測(cè)試[J].日用化學(xué)工業(yè)，2013，43（6）：450-452+462.

[15]尤卓瑩,何秋星，李馨恩，等.四物湯美白功效評(píng)價(jià)及其藥效關(guān)系研究[J].日用化學(xué)工業(yè)，2015，45（1）：45-48.

[16]CHANGTS.An updated review of yrosinase inhibitors [J].International Journal of Molecular Sciences，2009，10(6):2440-2475.

[17]劉艷杰，王倩，姜民，等.基于譜效-構(gòu)效關(guān)系篩選大黃中酪氨酸酶活性抑制成分的方法研究[J].中草藥，2012，43（11）：2120-2126.

[18]Piao XL,Baek SH,Park MK,et al.Tyrosinase inhibitory Furanocoumarin from Angelica dahurica[J].Biol Pharm Bull,2004,27(7):1144-1146.

[19]Ahmad VU,Ullah F,Hussain J,et al.Tyrosinase inhibitors from Rhododendron collettianum and their structure-activity relationship(SAR)studies[J].Chem Pharm Bull,2004，52(12):1458-1461.

[20]Tan C,Zhu W,Lu Y.Aloin,cinnamic acid and sophorcarpidineare potent inhibitors of tyrosinase[J].Chin Med J(Engl),2002,115(12):1859-1862.

[21]Chang YH,Kim C,Jung M,etal.Inhibition of melanogenesis by selina-4(14），7(11)-dien-8-one isolated from atractylodis rhizoma alba[J].Biol Pharm Bull,2007,30(4):719-723.