劉 菲

（1．陜西學(xué)前師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，陜西西安 710061；2．陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062）

昆蟲酚氧化酶研究進(jìn)展

劉 菲1，2

（1．陜西學(xué)前師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，陜西西安 710061；2．陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062）

酚氧化酶（phenoloxidase，PO）屬于3型含銅蛋白（type－3－copper－containing proteins），該蛋白家族在自然界中廣泛存在，并行使著多種多樣的生理學(xué)重要功能。酚氧化酶是黑色素合成中最重要的酶之一，外源病原物的殺死、血液凝集、抗菌肽表達(dá)、傷口愈合和糞便黑化都與酚氧化酶有著密切的關(guān)系。酚氧化酶在昆蟲體內(nèi)以酚氧化酶原（prophenoloxidase，PPO）的形式存在。本文主要從酚氧化酶的來源、檢測(cè)、結(jié)構(gòu)、激活及其功能等方面進(jìn)行綜述，以期為進(jìn)一步探究酚氧化酶在農(nóng)業(yè)病蟲害防治方面的可能應(yīng)用提供新思路。

酚氧化酶；來源；檢測(cè)；結(jié)構(gòu)；激活；功能

酚氧化酶（phenoloxidase，PO）屬于3型含銅蛋白（type－3－copper－containing proteins），該蛋白家族在自然界中廣泛存在，如高等動(dòng)物體內(nèi)的酪氨酸酶（Tyrosinase）、植物的兒茶酚氧化酶（Poly phenoloxidase，PPO）、節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白（Hemocyanin）和昆蟲及蝦蟹的酚氧化酶［1］。3型含銅蛋白具有多種不同的生理功能。高等動(dòng)物的酪氨酸酶存在于皮發(fā)和神經(jīng)系統(tǒng)之中，該酶的功能異常將導(dǎo)致白化病和帕金森癥等疾?。?3］，植物的PPO在個(gè)體受損傷后可以被激活，進(jìn)而引起褐化并影響食物的品質(zhì)［4］。而昆蟲酚氧化酶是一個(gè)非常重要的免疫蛋白，在血淋巴中以酚氧化酶原（prophenoloxidase，PPO）的形式存在。本文從來源、檢測(cè)、結(jié)構(gòu)、激活及其功能等方面綜述昆蟲PPO的研究進(jìn)展，以期為進(jìn)一步探究酚氧化酶在農(nóng)業(yè)病蟲害防治方面的可能應(yīng)用提供新思路。

1 昆蟲酚氧化酶的來源

PPO主要是由血細(xì)胞合成的，黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）幼蟲含有三種分化的血細(xì)胞類型，分別是漿細(xì)胞（plasmatocytes）、含晶細(xì)胞（crystal cells）和層狀細(xì)胞（lamellocytes），這三種血細(xì)胞都是由其前體原血球細(xì)胞（prohemocyte）分化而來［5］。果蠅的基因組中含有3個(gè)PPO基因（PPO 1／CG5779，PPO2／CG8193，PPO3／CG2952），PPO1和PPO2主要在含晶細(xì)胞中表達(dá)［6］，PPO3主要在層狀細(xì)胞中表達(dá)［7］。而在其他許多昆蟲中，PPO都是由血細(xì)胞中的擬絳色細(xì)胞（oenocytoid）合成的［8］。

果蠅PPO在含晶細(xì)胞中的表達(dá)依賴于RUNX（Runt－related transcription factor）相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Lz（Lozenge）和GATA轉(zhuǎn)錄因子Srp（Serpent）［9］，全基因組芯片分析結(jié)果顯示，果蠅PPO基因是組成性表達(dá)，其RNA水平不受細(xì)菌或真菌感染的影響［7－9］。然而，在果蠅受到寄生蜂感染48－72 h后，PPO3的RNA水平顯著上調(diào)［5］。并且，PPO3的過表達(dá)能夠誘導(dǎo)S2細(xì)胞果蠅本身的組成性黑化，PPO1和PPO2并沒有這種現(xiàn)象［6］。PPO3可能在層狀細(xì)胞參與的抗寄生蟲的黑化反應(yīng)中起著重要的作用。

雖然血細(xì)胞是PPO的主要來源，但是其他組織也可能合成PPO。家蠶（Bombyx mori）翅原基與造血器官構(gòu)成復(fù)合體，粘著在體壁內(nèi)表面上［10］。刁玉璞等人發(fā)現(xiàn)家蠶翅原基中含有PPO［11］。在體外培養(yǎng)的條件下，PPO能夠釋放到培養(yǎng)基中。將翅原基手術(shù)摘除后，血淋巴中的PPO含量明顯減少，證明翅原基含有PPO并可能作為血淋巴PPO的來源之一。用滅活的細(xì)菌刺激家蠶，發(fā)現(xiàn)翅原基PPO的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯的改變，說明翅原基中的PPO可能與家蠶的免疫應(yīng)答無關(guān)，但卻是血淋巴PPO的穩(wěn)定來源之一［11］。邵奇妙等人發(fā)現(xiàn)家蠶后腸細(xì)胞也可產(chǎn)生PPO，并將其分泌到后腸內(nèi)容物當(dāng)中，這些PPO使得后腸內(nèi)容物和糞便黑化，從而減少糞便中的細(xì)菌［12］。在果蠅中，PPO1基因的突變Black cells（Bc），在果蠅的幼蟲中產(chǎn)生無功能的含晶細(xì)胞。Bc抑制了由Spn27A突變引起的血淋巴組成性黑化，但是它不能阻止由Spn77Ba突變引起的氣管上皮的黑化，這意味著與氣管黑化相關(guān)的PPO不是來源于含晶細(xì)胞，而是由上皮細(xì)胞合成的［13］。

2 昆蟲酚氧化酶的檢測(cè)

檢測(cè)PPO的傳統(tǒng)方法是運(yùn)用免疫染色或原位雜交的方法來檢測(cè)PPO蛋白或轉(zhuǎn)錄本［14］。例如，家蠶和煙草天蛾（Manduca sexta）的免疫染色和原位雜交結(jié)果表明其擬絳色細(xì)胞能產(chǎn)生PPO［8，14］。然而由于昆蟲PPO抗體的缺乏或其他限制，想在大多數(shù)昆蟲中檢測(cè)PPO并不容易。有一些簡(jiǎn)便的方法可以檢測(cè)細(xì)胞和組織中的PPO。昆蟲PPO能被許多陽(yáng)離子或陰離子洗滌劑和醇類（如甲醇、乙醇和異丙醇）通過未知的機(jī)制激活，研究者可以利用這個(gè)特性來檢測(cè)細(xì)胞和組織中的PPO。凌爾軍等人發(fā)現(xiàn)，用35%乙醇配制的濃度為1mg／ml的L－DOPA溶液孵育血細(xì)胞，除了家蠶擬絳色細(xì)胞和漿細(xì)胞外，還能鑒定出一部分原血球細(xì)胞和顆粒細(xì)胞含有PPO［15］?；谶@種方法，凌爾軍等人研究了煙草天蛾的包囊和黑化反應(yīng)［16］，刁玉璞等發(fā)現(xiàn)家蠶翅原基含有PPO［11］。該方法還可以運(yùn)用于檢測(cè)非變性聚丙烯酰胺凝膠中的PPO。例如，果蠅PPO1和PPO2在同一張非變性聚凝膠上呈現(xiàn)兩條不同的條帶［17］。

3 昆蟲酚氧化酶的結(jié)構(gòu)

PPO和血藍(lán)蛋白、兒茶酚氧化酶以及酪氨酸酶都屬于3型含銅蛋白，該類蛋白的每個(gè)活性中心口袋含有2個(gè)銅離子和3個(gè)組氨酸［18］。煙草天蛾P(guān)PO異二聚體的晶體結(jié)構(gòu)顯示，在Arg51和Phe52之間的剪切導(dǎo)致了構(gòu)象的改變，兩個(gè)亞基都有一個(gè)特定的苯丙氨酸（F）從活性位點(diǎn)移出，從而使活性中心底物結(jié)合的位點(diǎn)暴露出來，這個(gè)F氨基酸被稱為place holder。煙草天蛾P(guān)PO1／2晶體結(jié)構(gòu)的解析完成，為其功能研究提供了更多的參考依據(jù)［18］。

各種昆蟲中PPO基因的數(shù)目差別很大，在鱗翅目昆蟲中PPO基因通常較少，如煙草天蛾和家蠶均分別具有2個(gè)PPO基因。在果蠅基因組中，目前發(fā)現(xiàn)3個(gè)PPO基因。而在岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）和埃及伊蚊（Aedes aegypti）的基因組中，則分別發(fā)現(xiàn)多達(dá)9個(gè)和10個(gè)PPO基因［19］。這些不同的PPO是否具有不同的理化性質(zhì)和功能？劉菲等人將果蠅的3個(gè)PPO（PPO1、PPO2和PPO3）在果蠅血細(xì)胞系S2中進(jìn)行了表達(dá)，發(fā)現(xiàn)果蠅的3個(gè)PPO蛋白有著非常不同的理化性質(zhì)，并對(duì)銅離子有著不同的反應(yīng)［6］。其中，r PPO1和r PPO2需要額外的Cu2+才能有活性，但r PPO3表達(dá)后就有活性，加入Cu2+后會(huì)發(fā)生自激活。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為PPO的激活是通過絲氨酸蛋白酶（serine proteases）將PPO剪切成為PO來實(shí)現(xiàn)的，但r PPO3在自激活后并沒有被酶剪切成為PO3，即rPPO3在酶原形式就有活性。另外，rPPO1和rPPO2對(duì)于Cu2+有著不同的反應(yīng)速度［6］。這些特性與各個(gè)PPO蛋白的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，參照煙草天蛾P(guān)PO的晶體結(jié)構(gòu)，通過同源建模及突變體的表達(dá)，結(jié)果顯示，有兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)可能通過改變PPO活性中心口袋的大小影響3個(gè)PPO的活性。另外，PPO3 C－端一段序列的缺失也能影響PPO3的活性以及自激活［20］。

4 昆蟲酚氧化酶的激活

酚氧化酶在血淋巴中是以酶原的形式存在的，含有N－端CLIP結(jié)構(gòu)域的血淋巴絲氨酸蛋白酶在PPO氨基端的特定位點(diǎn)，如在Arg－Phe位點(diǎn)將其剪切激活。這些PPO激活蛋白酶本身在識(shí)別微生物感染后作為蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的一部分所激活，在某些情況下，PPO的激活需要缺少酶活性的輔因子SPH（serine protease homolog）的參與。PPO激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)也受到絲氨酸蛋白酶抑制劑（serine protease inhibitor，serpin）的調(diào)控，因?yàn)楹诨磻?yīng)對(duì)于生物體本身也具有損傷作用，因此其在時(shí)間和空間上都受到嚴(yán)格的控制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，不受控制的黑化反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生過量的毒性中間產(chǎn)物，最終導(dǎo)致宿主的死亡［13］。

PPO激活的空間和時(shí)間調(diào)控發(fā)生在幾個(gè)水平。首先，PPO的激活依賴于對(duì)外源微生物細(xì)胞壁組分或其他觸發(fā)因子的識(shí)別，由此保證了黑化只在這些因子存在的地方發(fā)生。黑化觸發(fā)因子的識(shí)別導(dǎo)致了蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活。由于這些蛋白酶本來就以非活性的酶原形式存在，PPO能夠在需要黑化的地方很快地激活。運(yùn)用蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活PPO的另外一個(gè)好處是信號(hào)的放大，其中serpin也參與多個(gè)步驟的調(diào)控。在較大昆蟲的生化研究中表明，一旦PPO激活，PO的活性可能受聚類蛋白和一些PO抑制劑的調(diào)控，這樣就可以及時(shí)地關(guān)閉黑化反應(yīng)［21］。

路岸瑞等總結(jié)了昆蟲PPO激活的三種機(jī)制［22］。大多數(shù)PPO的激活都需要從PPO中保守的Arg－Phe位點(diǎn)進(jìn)行剪切，去掉N－端大約50個(gè)氨基酸。在家蠶中，最下游的酚氧化酶激活酶（PPO－activating enzyme，PPAE）將PPO1和PPO2從51RF52處剪切，成為有活性的PO1和PO2［22］。

在煙草天蛾中，PPO通過更加復(fù)雜的機(jī)制激活，已知三個(gè)直接剪切PPO的酚氧化酶原激活蛋白酶（prophenoloxidase activating proteinase，PAP）已被發(fā)現(xiàn)并鑒定出來。這三個(gè)PAP能夠在與家蠶相應(yīng)的保守位點(diǎn)（PPO1是51RF52，PPO2是49RV50）處直接剪切PPO。然而，剪切后的PO活性非常低，但當(dāng)輔助因子SPH存在時(shí)，PO的活性明顯提高［22］。

在東北大黑鰓金龜（Holotrichia diomphalia）中，三個(gè)PPO激活因子（PPO－activating factor，PPAF－I，PPAF－II和PPAF－III）已經(jīng)被鑒定出來，當(dāng)PPAF－I將Hd PPO1從保守的51RF52位點(diǎn)剪切后，得到的PO并沒有活性，當(dāng)混合的三種PPAF將純化的PPO1從162RA163處再次剪切后，才產(chǎn)生了有活性的PO［22］。

果蠅PPO1的預(yù)測(cè)剪切位點(diǎn)也是在Arg－Phe位點(diǎn)，而PPO2和PPO3是在Arg－Val位點(diǎn)，但體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，商品化的α－胰凝乳蛋白酶（α－chymotrypsin）至少在三個(gè)位點(diǎn)剪切PPO1，從而產(chǎn)生有活性的PO［22］。

在果蠅中，對(duì)PPO激活的信號(hào)通路了解的還很少。家蠶實(shí)驗(yàn)證明，識(shí)別病原物并引發(fā)免疫反應(yīng)的模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）尤其是肽聚糖識(shí)別蛋白（peptidoglycan recognition proteins，PGRPs）家族能夠激活PPO［23］。在果蠅中，PGRP－LE參與到微生物誘導(dǎo)的黑化中［24］。Imd信號(hào)通路信號(hào)上游的PGRP－LC的過表達(dá)導(dǎo)致幼蟲和成蟲的大量黑化［25］。在果蠅中，目前已鑒定出兩個(gè)絲氨酸蛋白酶，MP1（Melanization Protease 1）和MP2（Melanization Protease 2），在黑化級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活中起作用［26］。MP1或MP2的過表達(dá)都能誘導(dǎo)組成性的黑化和半致死，而MP1或MP2的敲除減少了微生物感染后PPO的激活和黑化反應(yīng)［26］?，F(xiàn)有的研究表明果蠅中有三個(gè)serpin參與調(diào)控黑化反應(yīng)。Spn27A是第一個(gè)鑒定出來的調(diào)控PPO激活和血淋巴黑化的serpin。Spn27A功能喪失的突變導(dǎo)致果蠅的黑化和半致死，Spn27A的過表達(dá)抑制了微生物誘導(dǎo)的PPO的激活［21］。Spn28D可能通過清除PPO，抑制微生物感染誘導(dǎo)的黑化和表皮著色，起到阻止PPO過早激活的作用［21］。Spn77Ba是果蠅呼吸系統(tǒng)氣管中的一個(gè)黑化調(diào)控因子［13］。

5 昆蟲酚氧化酶的功能

酚氧化酶屬于3型含銅蛋白，該蛋白家族在動(dòng)物、植物和相當(dāng)數(shù)目的微生物中都有發(fā)現(xiàn)并行使著多種多樣的生物學(xué)功能［18，22］。酚氧化酶是黑色素合成中最重要的酶之一，外源病原物的殺死、血液凝集、抗菌肽表達(dá)、傷口愈合和糞便黑化等多種功能都與酚氧化酶及其參與的黑化反應(yīng)有著密切的關(guān)系［12，21，22］。

在昆蟲的天然免疫系統(tǒng)中，Toll和Imd兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路控制著抗菌肽及其他免疫相關(guān)效應(yīng)分子的表達(dá)［27］。然而，面對(duì)病原微生物的入侵，兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路往往需要數(shù)小時(shí)到數(shù)天的時(shí)間來誘導(dǎo)其控制的效應(yīng)分子的表達(dá)。相反地，黑化反應(yīng)在感染發(fā)生后幾分鐘內(nèi)就可以起作用，其產(chǎn)生的黑色素及中間產(chǎn)物活性氧對(duì)病原物有著直接的毒性，將病原物在黑色素囊中隔離可以阻止它在宿主的擴(kuò)散［21］。正是由于其在體內(nèi)的快速激活，昆蟲PPO也是傷口愈合中的重要蛋白。黑化反應(yīng)中產(chǎn)生的黑色素在傷口的沉積有助于傷口愈合。因此，酚氧化酶在無脊椎動(dòng)物，特別是節(jié)肢動(dòng)物中是免疫防御的一個(gè)重要組成部分［21］。

在果蠅中，MP2 RNAi以后，PPO1和PPO2均不能被剪切，但通過感染革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌以及病原真菌，發(fā)現(xiàn)MP2 RNAi的果蠅中并不比野生型的果蠅敏感。在其他一些節(jié)肢動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，黑化對(duì)于抵抗細(xì)菌侵染的重要性在物種間有很大的差異。在岡比亞按蚊中，通過RNAi敲除PPO激活所必須的CLIPA8后，發(fā)現(xiàn)RNAi的蚊子在大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）感染后的表現(xiàn)與野生型類似。這個(gè)發(fā)現(xiàn)說明黑化反應(yīng)對(duì)于蚊子抗擊細(xì)菌感染并不重要［28］。然而黑化反應(yīng)對(duì)于煙草天蛾的免疫系統(tǒng)可能比較重要，比如，煙草天蛾的病原菌發(fā)光桿菌（Photorhabdus luminescens）的毒性依賴于一個(gè)可以抑制PO活性的化合物羥基芪（hydroxystilbene），缺乏這個(gè)化合物的細(xì)菌沒有毒性［29］。而且，通過RNAi抑制宿主PPO的表達(dá)后顯著地提高了煙草天蛾對(duì)于發(fā)光桿菌的敏感度［29］。酚氧化酶參與的黑化對(duì)于宿主抵御天敵黃蜂可能也有著非常重要的意義。在果蠅中，破壞黑化反應(yīng)的突變對(duì)于體內(nèi)寄生蟲黃蜂（Leptopilina boulardi）有著顯著降低的免疫能力［30］。

除了抵御微生物和寄生蟲侵染等功能外，昆蟲PPO還參與昆蟲糞便的黑化。邵奇妙等人的研究表明，家蠶后腸表皮細(xì)胞能夠產(chǎn)生PPO并釋放到后腸內(nèi)容物中，后腸PPO是植食性昆蟲食綠葉但分泌黑色糞便的原因。當(dāng)PO活性被PTU（phenylthiourea）所抑制，昆蟲會(huì)分泌綠色的糞便，且這些綠色糞便所含細(xì)菌的量，要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于黑色糞便。因此，昆蟲利用后腸PPO所參與的黑化反應(yīng)，清除糞便中所攜帶的潛在病原物，從而保證食物免受病原物的污染［12］。

6 展望

作為昆蟲一種重要的先天性免疫防御機(jī)制，黑化反應(yīng)的研究引起了廣泛的關(guān)注，而酚氧化酶作為黑化反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，一直是研究昆蟲先天性免疫的熱點(diǎn)。借助于遺傳學(xué)手段和煙草天蛾等的體外生化實(shí)驗(yàn)，對(duì)于昆蟲酚氧化酶的研究也越來越深入，但是對(duì)于其具體的激活和調(diào)控機(jī)制，還有待于進(jìn)一步的研究。近期煙草天蛾P(guān)PO異二聚體晶體結(jié)構(gòu)的解析完成，也為其功能研究提供了更多的參考依據(jù)。

類型3含銅蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上有很多相似性，且在自然界廣泛分布并行使著重要功能，由于昆蟲生長(zhǎng)周期短，昆蟲PPO的研究將是研究這一類蛋白家族很好的模型。

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［責(zé)任編輯 朱毅然］

Advances on the Research of Insect Phenoloxidase

LIU Fei
（1．College of Life Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China；2．Department of Biological Science and Technology，Shaanxi Xueqian Normal University，Xi’an 710061，China）

Phenoloxidase（PO），belongs to a group of type－3－copper－containing proteins，which distributes in the nature widely and possesses a variety of important functions．PO is one of the most important enzyme in the synthesis of melanin．Pathogen killing，blood coagulation，antimicrobial peptide expression，wound healing and feces melanization in insects are all closely related with the PO．PO exists in insects as an inactive form called prophenoloxidase（PPO）．In this paper，we mainly reviewed the recent advances on the research of the source，detection，structure，activation，and function of insect PO，in order to provide some new ideas for further exploring of the possible application of phenoloxidase in agricultural pest control．

phenoloxidase；source；detection；structure；activation；function

Q55

A

2095－770X（2015）06－0120－05

2015－04－15；

2015－06－12

中國(guó)博士后第56批面上資助項(xiàng)目（2014M562369），陜西學(xué)前師范學(xué)院引進(jìn)人才科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（2014DS008），陜西學(xué)前師范學(xué)院校級(jí)科研基金項(xiàng)目（2015YBKJ024）

劉菲，女，陜西西安人，陜西學(xué)前師范學(xué)院講師，理學(xué)博士，主要研究方向：昆蟲免疫學(xué)。