陳 夏，鄭景輝△，梁 健，簡維雄，秦偉夫，劉華盛，王 偉，吳發(fā)勝，付 蕾，趙曉芳，吳 誠

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院心血管內(nèi)科，南寧 530011;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所，長沙 410007;3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023)

冠心病心血瘀阻證患者尿液代謝組學(xué)的通路分析*

陳 夏1，鄭景輝1△，梁 健1，簡維雄2，秦偉夫1，劉華盛1，王 偉3，吳發(fā)勝1，付 蕾1，趙曉芳1，吳 誠1

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院心血管內(nèi)科，南寧 530011;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所，長沙 410007;3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023)

目的:探討冠心病心血瘀阻證患者尿液代謝組學(xué)的通路。方法:通路的生物學(xué)分析使用KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索和構(gòu)建，代謝產(chǎn)物分子注釋、相關(guān)的酶或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其相關(guān)性質(zhì)分析使用HMDB代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，代謝產(chǎn)物路徑可視化采用MetPA網(wǎng)絡(luò)軟件構(gòu)建。結(jié)果:冠心病心血瘀阻證患者代謝通路顯示，6個(gè)差異性代謝產(chǎn)物共參與了10條代謝路徑，其中“半乳糖代謝”、“酮體的合成和降解通路”影響值分別為0.00276和0.0000。結(jié)論:冠心病心血瘀阻證患者中“半乳糖代謝”、“酮體的合成和降解通路”發(fā)生變化參與其病理過程。

代謝組學(xué);心血瘀阻證;代謝通路;半乳糖代謝;酮體的合成和降解

尿液是人體代謝終產(chǎn)物之一，機(jī)體大部分生理病理過程的代謝終產(chǎn)物通過尿液排出體外。本課題組［1-4］前期運(yùn)用GC-MS開展了從大鼠到患者不同研究對象的冠心病血瘀證代謝組學(xué)研究。其中在對冠心病心血瘀阻證患者、冠心病非心血瘀阻證患者及健康組3組尿液代謝組學(xué)鑒定中發(fā)現(xiàn)，葡萄糖、甘油、木糖醇、馬尿酸、油酸酰胺、丙酮為冠心病心血瘀阻證患者尿液生物代謝產(chǎn)物譜。本研究在已經(jīng)確定的代謝產(chǎn)物譜的基礎(chǔ)上，利用MetPA、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)、HMDB(The Human Metabolome Database)等數(shù)據(jù)庫的生物學(xué)信息，分析冠心病心血瘀阻證患者相關(guān)的代謝過程，為中醫(yī)學(xué)證候本質(zhì)研究提供支持［5］。

1 材料與方法

1.1 代謝譜來源

本課題組前期實(shí)驗(yàn)中冠心病心血瘀阻證患者(6例)尿液代謝組學(xué)和冠心病非心血瘀阻證患者(16例)及健康組(10例)對比鑒定確定的差異產(chǎn)物:甘油(Glycerol)、油酸酰胺(Acrylamide)、葡萄糖(D-Glucose)、丙酮(acetone)、馬尿酸(hippuric acid)、木糖醇(D-Xylito)為冠心病心血瘀阻證尿液代謝產(chǎn)物譜。

1.2 分析軟件

代謝通路分析采用 KEGG (http://www.genome.jp/kegg/)、SMP(http://pathman.smpdb.ca/pathways/SMP00020/pathway)數(shù)據(jù)庫檢索構(gòu)建，代謝產(chǎn)物分子注釋、相關(guān)的酶或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其相關(guān)性質(zhì)分析采用HMDB(http://www.hmdb.ca/)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，代謝產(chǎn)物路徑可視化采用MetPA網(wǎng)絡(luò)軟件(metpa.metabolomics.ca/)繪制。

1.3 分析方法

將GC-MS質(zhì)譜分析確定的代謝產(chǎn)物放入MetPA對話框，Compound Label(代謝產(chǎn)物標(biāo)簽)選擇輸入:Compound name(代謝產(chǎn)物名稱);選擇物種為:Homo sapiens(人)，Over Representation Analysis (過代表分析);選擇:Hypergeometric Test(超幾何分布檢驗(yàn))，Pathway Topology Analysis(通路拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析);采用:Relative-betweeness Centrality(兩中心相關(guān))，然后注冊進(jìn)行通路模型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 冠心病心血瘀阻證患者代謝產(chǎn)物生物信息學(xué)注釋情況

表1顯示，對冠心病心血瘀阻證代謝組中6種差異表達(dá)產(chǎn)物在KEGG和HMDB數(shù)據(jù)庫中檢索，都能找到相應(yīng)的ID號碼，并提供較為詳盡的注釋。

2.2 冠心病心血瘀阻證患者代謝通路拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)分析

表2圖1顯示，冠心病心血瘀阻證患者6個(gè)差異代謝產(chǎn)物主要參與10條代謝路徑，分別是半乳糖代謝、酮體的合成和降解、糖酵解和糖異生、磷酸戊糖途徑、甘油脂代謝、丙酸甲酯新陳代謝、苯丙氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化、氨基糖和核苷酸糖代謝。

表1 冠心病心血瘀阻證患者代謝組產(chǎn)物生物信息學(xué)注釋

表2 冠心病心血瘀阻證患者代謝產(chǎn)物MetPA分析結(jié)果

圖1 冠心病心血瘀阻證患者代謝產(chǎn)物通路的MetPA分析概要圖

2.3 冠心病心血瘀阻證患者代謝產(chǎn)物通路分析

表2圖1顯示，通過對冠心病心血瘀阻證患者代謝產(chǎn)物通路拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，半乳糖代謝(Galactose metabolism)和酮體的合成與降解(Synthesis and degradation of ketone bodies)的影響值分別為0.00276和0.0(P＜0.05)，而其他通路影響值均P＞0.05。所以，以半乳糖代謝和酮體的合成與降解通路作為冠心病心血瘀阻證患者代謝組產(chǎn)物的主要通路，并做進(jìn)一步的分析。

2.3.1 半乳糖代謝通路 圖2顯示，半乳糖代謝通路在整個(gè)通路的原始P=0.0040673，拓?fù)浞治鲇绊懼禐?.00276;代謝譜中的甘油(C00116)和葡萄糖(C00031)兩種代謝產(chǎn)物參與了通路，其中甘油是在半乳糖基(C05401，Galactosylglycerol)的下游，葡萄糖為果糖(C00095，D-Fructose)、密二糖(C05402，Melibiose)和蔗糖(C00089，Sucrose)的共同中間產(chǎn)物。

2.3.2 酮體的合成和降解通路 圖3顯示，這條通路在整個(gè)通路的原始P=0.014879，拓?fù)浞治鲇绊懼禐?.0;在酮體的合成和降解通路中，代謝譜中的丙酮(C002076)物參與了通路代謝，是乙酰乙酸(C00164，Acetoacetic acid)的產(chǎn)物。

3 討論

圖2 冠心病心血瘀阻證患者半乳糖代謝通路結(jié)構(gòu)圖

圖3 冠心病心血瘀阻證患者酮體的合成和降解代謝通路結(jié)構(gòu)圖(圖中所示為KEGG ID，淺色背景的化合物即為本研究結(jié)果中參與代謝產(chǎn)物)

代謝組學(xué)作為后基因時(shí)代的一種全新的組學(xué)技術(shù)，利用高分離效率、高靈敏度及極低檢測限的儀器，以生物體內(nèi)低分子量物質(zhì)的動(dòng)態(tài)規(guī)律變化來闡釋生物體的生理病理變化趨勢，最終通過還原相關(guān)聯(lián)生物事件，揭示生物體的病理生理變化實(shí)質(zhì)和機(jī)制所在。以往對代謝組學(xué)經(jīng)典的分析方法是找出差別表達(dá)的代謝產(chǎn)物，而未見針對代謝產(chǎn)物進(jìn)行生物信息學(xué)分析。隨著生物信息學(xué)海量數(shù)據(jù)的產(chǎn)生，怎樣把這些數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成知識是擺在我們面前的重要課題。本研究根據(jù)以往的研究結(jié)果，采用生物信息的方法建立冠心病心血瘀阻證患者尿液代謝通路的拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)一步解釋代謝產(chǎn)物的生物學(xué)過程，為闡釋中醫(yī)證候的本質(zhì)提供理論支持。

半乳糖是由乳類食物中的乳糖水解而來，其代謝主要是通過半乳糖激酶(galactokinase，GALK)、半乳糖-1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶(galactose-1-phosphate，uridyltransferase，GALT)、尿苷二磷酸半乳糖-4-差向酶 (uridine diphosphate-4-galactose epimerase， GALE)及其所催化的酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟嵌焕?。此外，半乳糖還可通過代謝旁路還原為半乳糖醇或氧化為半乳糖酸。本研究中發(fā)現(xiàn)，代謝產(chǎn)物中甘油和葡萄糖參與了半乳糖代謝通路，這兩種產(chǎn)物在路徑中位于反應(yīng)的終端，說明在冠心病心血瘀阻證的病理變化中，半乳糖的代謝具有重要作用，是提供缺血心肌能量的重要物質(zhì)?？赡苁切募≡谌毖獱顟B(tài)下，蛋白質(zhì)分解供能不足，心肌的能量供應(yīng)由快速分解產(chǎn)生能量的糖代謝來提供。

酮體包含乙酸乙酯、β-羥基丁酸和丙酮，這3種物質(zhì)由脂肪酸β-氧化或其他代謝所產(chǎn)生的乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)行氧化分解而成，所以酮體是人體利用脂肪分解產(chǎn)生能量后的中間產(chǎn)物。值得注意的是，由于肝臟缺乏轉(zhuǎn)硫酶和乙酰乙酰硫激酶，所以肝臟氧化脂肪酸時(shí)能產(chǎn)生酮體，但不能利用酮體。而肝外組織則相反，在脂肪酸氧化過程中不產(chǎn)生酮體，卻能氧化由肝臟生成的酮體，這樣肝臟把碳鏈長的脂肪酸分解成分子較小易被其他組織供能的酮體，為肝外組織提供可利用的能源。對于不能利用脂肪酸的腦組織來說，利用酮體作為能源具有重要意義，同樣情況下心肌缺血、缺氧發(fā)生壞死病理狀態(tài)下，由于心臟組織中沒有脂肪貯備供能，也需要利用酮體作為主要的能量來源，這成為臨床治療中保護(hù)心肌、提供能量的借鑒思路。

本實(shí)驗(yàn)首次通過模式識別以及通路分析方法構(gòu)建了冠心病心血瘀阻證患者尿液代謝物相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。獨(dú)特的通路分析方法可以全局性地描繪出生物化學(xué)的擾動(dòng)以及病理損傷的潛在機(jī)制，為進(jìn)一步揭示中醫(yī)證候本質(zhì)、中醫(yī)藥多因多效多靶點(diǎn)的作用機(jī)制提供思路。當(dāng)然這些潛在的代謝通路或靶點(diǎn)尚需通過生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和臨床觀察進(jìn)一步驗(yàn)證。

［1］簡維雄，黃獻(xiàn)平，陳清華，等.基于氣相色譜-質(zhì)譜的大鼠心血瘀阻證血漿代謝組學(xué)研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27 (4):796-798.

［2］簡維雄，陳清華，黃獻(xiàn)平，等.大鼠心血瘀阻證心肌組織代謝組學(xué)的研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32(4):515-520.

［3］簡維雄，袁肇凱，黃獻(xiàn)平，等.冠心病心血瘀阻證血漿代謝組學(xué)的檢測分析［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，30(6):579-584.

［4］簡維雄，袁肇凱，黃獻(xiàn)平，等.冠心病心血瘀阻證尿液代謝組學(xué)的檢測分析［J］.中醫(yī)雜志，2010，51(8):729-732.

［5］Xia J，Wishart DS.MetPA:a web-based metabolomics tool for pathway analysis and visualization［J］.Bioinformatics，2010，26 (18):2342-2344.

R541.4

A

1006-3250(2015)01-0069-03

2014-09-23

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2013DA38021)-基于系統(tǒng)生物學(xué)方法中藥復(fù)方對BMSCs作用靶點(diǎn)及轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究;廣西壯族自治區(qū)教育廳科研項(xiàng)目(201203YB113)-基于代謝組學(xué)的冠心病心血瘀阻證特征研究;廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(xiàng)課題(GZPT1219)-冠心病血瘀證遺傳特征的研究;廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳科研課題(Z2012181)-廣西地區(qū)冠心病血瘀證遺傳特征研究

陳 夏(1977-)，女，廣西南寧人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事中西醫(yī)結(jié)合心腦血管疾病的臨床與基礎(chǔ)研究

△通訊作者:鄭景輝(1976-)，男，山東濱州人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，從事心腦血管疾病的中西醫(yī)結(jié)合臨床與基礎(chǔ)研究，Tel:0771-2238816，15277103622，E-mail:jinghuizheng@yeah.net。