丁西朋，張 龍，羅小燕，嚴琳玲，劉國道，白昌軍

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州571737)

隨著育種業(yè)和種子貿(mào)易的發(fā)展，植物新品種權作為知識產(chǎn)權的一種形式，其重要性越來越突出。DUS測試，即特異性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和穩(wěn)定性(Stability)測試，是植物新品種保護的技術基礎和授權的科學依據(jù)［1］。建立和完善DUS 測試技術體系，對于植物新品種權保護的發(fā)展有重要作用和現(xiàn)實意義。標準品種是植物新品種DUS 測試中對品種性狀尤其是數(shù)量性狀進行客觀描述的參照品種，是DUS測試技術體系的重要組成部分，構建標準品種完整的形態(tài)性狀及指紋圖譜數(shù)據(jù)庫是開展植物品種DUS 測試的必備數(shù)據(jù)基礎［2］。

傳統(tǒng)的DUS 測試主要以植物的表觀形態(tài)特征為基礎，測試結果受環(huán)境影響大、穩(wěn)定性差、測試周期長，嚴重地阻礙了我國植物新品種授權速度［3］。因此，植物新品種DUS 快速測試技術的研究和建立十分緊迫。以分子標記為基礎的DNA 指紋技術具有測試周期短、不受環(huán)境影響、易于自動化等優(yōu)勢，是DUS 快速測試技術的發(fā)展方向［4］。SSR(Simple Sequence Repeats)標記具有數(shù)量豐富、穩(wěn)定重復性好、多態(tài)性高、共顯性、操作簡單等優(yōu)點，被認為是植物新品種DUS 測試中較理想的標記技術，已經(jīng)成功應用于棉花(Gossypium hirsutum)［5］、油菜(Brassica napus)［6］、大麥(Hordeum valgure)［7］、西 瓜(Citrullus lanatus)［8］、玉 米(Zea mays)［9］、水稻(Oryza sativa)［10］、小麥(Triticum aestivum)［11］和番茄(Lycopersicon esculentum)［11］等多種農(nóng)作物標準品種的指紋圖譜構建及DUS 測試中。

柱花草(Stylosanthes)為多年生豆科植物，具有適應性廣、耐干旱、耐酸瘠土、抗病性強、飼草產(chǎn)量和營養(yǎng)價值高等特點，是世界上熱帶及亞熱帶地區(qū)最重要的放牧和刈割兼用型豆科牧草［12］。我國于1957 年開始從國外引進柱花草進行栽培，先后培育出維拉諾柱花草(S． hamata cv． Verano)、熱 研2 號 柱 花 草(S．guianensis cv． Reyan No． 2)、熱引18 號 柱花草(S．guianensis cv． Reyin No． 18)、熱研20 號柱花草(S．guianensis cv． Reyan No． 20)等 多 個 柱 花 草 優(yōu) 良 品種［13－14］。柱花草屬于典型的自花授粉植物，且在開花之前已經(jīng)授粉，異交率僅為1% ～2%［15－16］。柱花草屬包含約50 個種或亞種，染色體基數(shù)為10，大部分柱花草為二倍體植物(2n=20)，也有部分為四倍體或六倍體(2n=40 或2n=60)植物［17］。2012 年，農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 柱花草》報批稿，指南中提出了柱花草DUS 測試的24 個必測植物學性狀。中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究中心通過對192 份柱花草種質(zhì)的植物學性狀進行測試，對該DUS 測試指南提出修改建議并確定了15 個標準品種［18］。隨著柱花草品種的增多，其形態(tài)特征將會越來越復雜，使得依據(jù)形態(tài)性狀進行柱花草品種鑒別越來越困難，因此，將SSR 標記技術引入到柱花草DUS 測試中十分必要。據(jù)報道，在柱花草中可用的SSR 標記共139 個，分別來自柱花草屬的不同種，其中44 個來自圭亞那柱花草(S． guianensis)、26 個來自大頭柱花草(S． macrocephala)、23 個來自灌木柱花草(S． seabrana)、23 個來自頭狀柱花草(S． capitata)，其余來自其他14 個不同的柱花草種［19－24］。熱帶牧草中心熱帶牧草研究中心對其中123 個SSR 標記在8 個柱花草種間的轉(zhuǎn)移性進行了分析，結果表明，44 個在8 種柱花草中都能有效擴增，其中26 個多態(tài)性較好［25］。本研究在前期工作基礎上，利用25 個SSR 標記對15 個柱花草DUS 測試標準品種進行遺傳多樣性分析，構建15 份標準品種的DNA 指紋圖譜QR 二維碼數(shù)據(jù)庫，以期為SSR 標記技術在柱花草DUS 測試中應用奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

試驗材料除了《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南柱花草》中列出的圭亞那柱花草、有鉤柱花草(S． hamata)、糙柱花草(S． scabra)、頭狀柱花草標準品種外，還包括熱帶牧草中心對《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 柱花草》驗證后建議新增的圭亞那柱花草、大頭柱花草、馬弓形柱花草(S． hippocampoides)、矮柱花草(S． humilis)以及細莖柱花草(S． gracilis)等其他標準品種［18］，共計15 份柱花草標準品種(表1)，均種植在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究中心基地，每個小區(qū)面積為24 m2，株距為80 cm，行距為100 cm，走道為1．5 m，四周設置保護行，每小區(qū)種植總株數(shù)為42。

表1 15 份柱花草DUS 測試標準品種Table 1 15 Stylosanthes standard cultivars for DUS testing

1．2 DNA 抽提及SSR 分析

將去皮的柱花草種子在80 ℃水中浸泡5 min，然后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽，發(fā)芽后移至14 L 塑料盆中進行營養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)1 個月后，每份標準品種隨機挑選5 株，對葉片進行混合取樣，置于液氮中保存。按照筆者所在實驗室采用的改良CTAB 法提取柱花草總DNA［25］，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品。SSR 標記選用筆者所在實驗室已經(jīng)篩選過在8個不同柱花草中多態(tài)性較好的25 個標記(表2)［25］，均由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應體系為20 μL 體系:1 μL 50 ng·μL－1模板，0．8 μL 5 μmol·μL－1上下游混合引物，0． 3 μL 10 μmol·μL－1dNTPs，2 μL 10 × PCR Buffer，0．2 μL 5 U·μL－1Taq聚合酶，ddH2O 補足。PCR 程序為:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán);72 ℃延伸5 min。8%聚丙烯酰胺凝膠(8 mL 30%丙烯酰胺/N，N’－亞甲基雙丙烯酰胺=29/1、300 μL 10%過硫酸銨、30 μL TEMED、3 mL 10 × TBE、18．7 mL H2O)電泳，銀染檢測。

1．3 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)每對SSR 引物對每份材料的擴增產(chǎn)物電泳圖在Excel 表格中進行統(tǒng)計，位點由大到小依次記錄，同一位點處，有擴增條帶的記為“1”，沒有擴增的就記為“0”。用NTSYS－pc 2．10e 軟件進行非加權組平均(Unweighted Pair－group Method with Arithmetic Means，UPGMA)聚類分析，其中Qualitative data 計算遺傳相似系數(shù)(Genetic Similarity，GS)［26］，并利用FreeTree 軟件［27］通過1 000 次重抽樣對聚類圖進行bootstrap 分析。利用POPGEN 1．32軟件分析每對SSR 引物等位基因頻率(Allele Frequency)、等位基因數(shù)(Number of Alleles，Na)、有效等位基因數(shù)(Effective Number of Alleles，Ne)、Shannonx 信息指數(shù)(Shannon’s Information Index，I)及Nei’s 多樣性指數(shù)(Nei’s Gene Diversity，He)［28］。根據(jù)等位基因頻率計算每個SSR 標記的多態(tài)性信息含量(Ploymorphism Information Content，PIC)，其計算公式為:

式中，n 表示每個SSR 標記檢測到的等位基因數(shù)目，Pi、Pj表示第i、j 個等位基因在供試材料中出現(xiàn)的頻率［29］。

表2 所選25 個SSR 標記信息Table 2 The information of 25 SSR markers used in this study

1．4 指紋圖譜的構建

DNA 指紋圖譜構建參照范建光等［8］、宋海斌等［30］圖譜代碼構建的方法，采用英文字母與數(shù)字組合的方式，其中英文字母按照已篩選出的核心引物字母編號(A、B、C、…)依次排列(表2)，組成的數(shù)字則表示各個引物在不同標準品種中對應的基因型(將SSR 引物在所有標準品種中的PCR 產(chǎn)物按照分子量由大到小依次排列，用其數(shù)字順序表示對應標準品種的基因型)。如西卡柱花草部分指紋圖譜QR編碼為A2B6，A2 表示SSR4 引物在西卡柱花草中的基因型為2(SSR4 引物在西卡柱花草中PCR 產(chǎn)物的分子量是所有標準品種中第二大)，B6 表示SSR5 引物在西卡柱花草中的基因型為6(SSR5 引物在西卡柱花草中PCR 產(chǎn)物的分子量居所有標準品種中第六大)。利用25 個SSR 標記在西卡柱花草的基因型，最終形成西卡柱花草DNA指紋圖譜的QR編碼為A2B6C4D1E6F2G4 H1I3J2K3L9M2N1O1P1Q2R3S7T2U5V3W3X1Y1，將 15個標準品種的QR 編碼利用廈門聯(lián)圖網(wǎng)絡科技有限公司開發(fā)的在線二維碼生成軟件(http://www． liantu．com/shiliang/)生成對應的矢量二維碼，并作圖。

2 結果與分析

2．1 SSR 標記擴增分析

利用POPGEN 1．32 軟件對分析25 個SSR 標記在15 個柱花草標DUS 測試標準品種中的遺傳多樣性相關參數(shù)進行了分析(表2)，結果顯示，25 個SSR 標記在15 個柱花草標準中均具有多態(tài)性，共產(chǎn)生132 個等位基因，每個標記產(chǎn)生3 ～9 個等位基因，平均產(chǎn)生5．280 個;每個標記的有效等位基因數(shù)為1．751 ～7．258個，平均3．498 個;每個標記的Nei’s多樣性指數(shù)為0．429 ～0．862，平均0．680;各SSR 標記的Shannonx 信息指數(shù)為0．820 ～2．084，平均1．368;另外，各SSR 標記的多態(tài)性信息含量(PIC)平均為0．638，變化范圍為0．393 ～0．847，其中SSR58 的PIC 值最低，為0．393，SSR35 的PIC 值最高，為0．847，25 對SSR 引物的多態(tài)性信息含量主要集中在0．600 ～0．800，表明本研究中SSR 標記表現(xiàn)出較高多態(tài)性。

2．2 標準品種聚類分析

采用NTSYS－pc 2．10e 軟件中的非加權組平均法(UPGMA)，對15 個柱花草DUS 測試標準品種進行聚類分析(圖1)，品種間的遺傳相似系數(shù)介于0．500 ～0．992，平均值為0．714，聚類分析結果顯示柱花草不同品種間的變異較大。當遺傳相似系數(shù)為0．570 時，可將15 個柱花草標準品種分為兩個類群，其中第1 個類群主要包含西卡柱花草、有鉤柱花草、矮柱花草、頭狀柱花草及大頭柱花草，而第2 個類群主要為圭亞那柱花草，另外還包括馬弓形柱花草和細莖柱花草。在第1 個類群中，西卡柱花草、有鉤柱花草及矮柱花草的遺傳距離更為接近，頭狀柱花草和大頭柱花草同樣能劃分為1 個亞群;第2 類群中，圭亞那柱花草Tardio 與馬弓形柱花草和細莖柱花草可聚為同一亞類。

利用SSR 標記對15 份柱花草標準品種進行聚類分析的結果(圖1)與熱帶牧草中心前期對192 份柱花草種質(zhì)資源聚類分析時的結果一致，依照DUS 測試指南中測試性狀進行聚類分析后也可將不同種質(zhì)資源劃分為兩個大的類群，其中第1 個類群以灌木型柱花草為主，第2 個類群主要是草本型柱花草［18］。性狀測試與分子標記的聚類分析結果一致，表明利用SSR 標記構建指紋圖譜作為柱花草品種評定標準具有可行性。

2．3 15 份柱花草標準品種指紋圖譜的構建

本研究中不僅運用25 對核心SSR 引物建立了15 個柱花草DUS 測試標準品種的指紋圖譜(表3)，還依據(jù)DNA 指紋圖譜組成QR 編碼，通過在線二維碼生成軟件對標準品種進行二維編碼(圖2)，最終構建成15 份柱花草DUS 測試標準品種DNA 指紋圖譜的QR 二維碼數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫所包含的主要信息:編號為該標準品種在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物資源品種研究所熱帶牧草研究中心柱花草種質(zhì)資源的系統(tǒng)編號，材料名稱為標準品種名稱，DNA 指紋圖譜為25 對核心SSR 引物及其對應的基因型編號，如編號為2 的柱花草標準品種，其材料名稱為西卡 柱 花 草， 對 應 的DNA指紋圖譜為A2B6C4D1E6F2G4H1I3J2K3L9 M2 N1 O1 P1 Q2 R3 S7 T2 U5 V3 W3 X1 Y1。而DNA指紋圖譜QR 編碼生成二維碼在今后的育種工作中能夠更方便更準確地通過掃描二維碼獲得該品種的相關信息，這樣為實現(xiàn)柱花草品種鑒定的自動化和信息化提供基礎，為今后品種鑒別和育種等工作提供直接證據(jù)。

3 討論與結論

隨著作物種質(zhì)資源的不斷挖掘，育種材料背景日益狹窄，僅僅依靠目前傳統(tǒng)的DUS 測試技術以植物學性狀進行品種鑒別的方法是不可取的。一方面，植物學性狀受環(huán)境影響較大，影響DUS 測試的準確性，且觀測周期長，一般需要2 ～3 年的田間重復試驗;另一方面，標準品種存在不穩(wěn)定的因素，相近品種依據(jù)植物學性狀分辨困難［3］。因此，基于DNA多態(tài)性的分子標記技術正在成為植物新品種DUS 測試的發(fā)展方向，RAPD、ISSR、AFLP 和SRAP 等分子標記已先后被用于植物品種鑒定［4］。這些標記均是采用無基因組序列信息的標記技術，盡管有一定的實用性，但標記隨機性強、穩(wěn)定差［17］。SSR 技術具有共顯性、重復性好等優(yōu)點，被《植物品種鑒定DNA 指紋方法 總則》NY/T2594 －2014 推薦為當前各植物品種DNA 指紋鑒定的主要標記方法。

圖1 柱花草DUS 測試標準品種聚類分析Fig．1 Clustering analysis of Stylosanthes sample cultivars based on SSR markers

目前，SSR 標記在柱花草中主要應用于遺傳多樣性分析與核心種質(zhì)的構建。Chandra 等［17］利用BAC 文庫和EST序列開發(fā)了41 個SSR 標記，并利用這些SSR 標記對20 份灌木柱花草種質(zhì)進行了遺傳多樣性分析。Santos－Garcia等［31］利用20 個SSR 標記對150 個圭亞那柱花草種質(zhì)進行了遺傳多樣性分析，將其分為9 類。Santos－Garcia 等［32］利用SSR 標記對134 份大頭柱花草種質(zhì)和192 份頭狀柱花草種質(zhì)進行了遺傳多樣性分析，最終確定了分別含有23 份大頭柱花草和13 份頭狀柱花草的核心種質(zhì)。

本研究用25 個SSR 標記對15 份柱花草DUS 測試標準品種進行檢測，共檢測到132 個等位基因，每個標記可檢測到3 ～9 個等位基因，平均為5． 280 個;每個SSR 標記的多態(tài)性信息含量為0．393 ～0．847，平均為0．638，說明SSR 標記具有較高的遺傳多態(tài)性。本研究中聚類分析表明，25 個SSR 標記能有效地將15 份柱花草DUS 標準品種分為兩大類，該聚類結果與用其他分子標記分析的結果相一致［33－35］。

表3 柱花草標準品種DNA 指紋圖譜Table 3 The DNA fingerprinting of Stylosanthes sample cultivars

圖2 柱花草DUS 測試標準品種DNA 指紋圖譜QR 編碼Fig． 2 The DNA fingerprinting QR codes of Stylosanthes example cultivars in DUS test

DNA 指紋圖譜的構建方法也有多種，包括巫桂芬等［36］利用標記多態(tài)性產(chǎn)生的等位變異構建法，劉娟等［37］運用Gel 2．0 軟件對特征引物擴增的凝膠帶譜構建指紋模式圖譜，楊青松等［38］利用特征引物組合構建個體特異的DNA 指紋圖譜法以及本研究參考的范建光等［8］、宋海斌等［30］圖譜代碼構建法形成DNA 指紋圖譜的QR 編碼生成二維碼等，相比之下指紋圖譜QR編碼構建法包含信息量豐富，準確可靠，并且在實際生產(chǎn)中應用簡便。

由于柱花草遺傳學背景研究較少，已報道的SSR標記數(shù)目有限，本研究選取的25 個SSR 標記可能不能夠很好的反映不同柱花草種質(zhì)資源間的遺傳差異，今后應開發(fā)更多的SSR 標記，并將多態(tài)性高、條帶清晰的SSR 標記加入到已構建好的指紋圖譜庫中，以更好地將SSR 標記技術應用于柱花草的DUS 測試和新品種鑒定。

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