胡雪蓮，劉 菲，王莉娜

（北京燕京啤酒集團公司技術(shù)中心 啤酒釀造技術(shù)北京市重點實驗室，北京 101300）

葛根是我國分布較廣的藥食同源植物，其藥用價值極高，素有“亞洲人參”之美譽，具有解肌退熱、生津透診、升陽止瀉等功能[1]。其有效成分葛根素（puerarin）化學(xué)名為8-β-D-葡萄吡喃糖-4’,7二羥基異黃酮，分子質(zhì)量為416.38 u[2]，由于其具有抗炎解熱、擴張冠狀動脈血管、增加冠狀動脈血流量及降低血壓等作用[3]，近年已被用于膠囊、口服液、片劑、保健茶等保健食品中。市場上的納豆作為一種功能性保健食品，具有溶血栓、抗腫瘤、降血壓、降血脂、抗氧化性、防止骨質(zhì)疏松、促凝血等對人體較高的生理功能及營養(yǎng)保健作用，正在被越來越多的消費者所關(guān)注[4]。葛根素作為功能性有效成分的一種，將其添加到納豆膠囊中可以更好的發(fā)揮擴張腦血管、降低膽固醇、改善血小板功能、抑制血小板凝集、降低血液粘稠度、改善微循環(huán)等功效。因此富含葛根素的納豆膠囊中葛根素的準確分析對保證產(chǎn)品質(zhì)量、控制工藝過程具有十分重要的意義。目前國內(nèi)外已有對原植物[3，5]、保健食品[6-7]及藥品[8-9]中葛根素含量測定的相關(guān)報道。而輔助添加了葛根提取物的納豆膠囊中葛根素含量分析并未見有關(guān)報道。納豆是黃豆經(jīng)發(fā)酵而成的風(fēng)味豆制品，其中富含大量蛋白、脂肪、粗多糖等成分，現(xiàn)市售護肝型納豆膠囊產(chǎn)品除添加了葛根提取物外，還添加有靈芝粉等，產(chǎn)品基質(zhì)更為復(fù)雜，測定復(fù)雜基質(zhì)樣品中的微量葛根素組分是一項困難的工作。關(guān)于葛根素的定量分析方法較多，如紫外分光光度法[8，10]、毛細管膠束電動力學(xué)色譜法[5，9]、薄層層析法[10-11]、熒光法、高效液相色譜（HPLC）法[12-14]等。本實驗建立了富含葛根素納豆膠囊產(chǎn)品中葛根素含量的高效液相色譜（high performance liquid chromatogrophy，HPLC）分析方法，該方法快速、簡便、準確可靠，重現(xiàn)性好，可用于納豆膠囊的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根素標準品：北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司；甲醇（HPLC級）：美國Fisher公司；Milli-Q超純水：美國Milli-pore公司；乙酸（99.5%）（分析純）：北京化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 2489高效液相色譜儀（真空脫氣器、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、UV檢測器）：美國Waters公司；KQ-500DE型超聲振蕩器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準儲備溶液及使用液的配制

標準儲備溶液：精確稱取葛根素標準品200 mg于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)70%的甲醇水溶解定容，配制成質(zhì)量濃度為2 000 mg/L的貯備液，于4 ℃冷藏備用。

標準使用液：將貯備液稀釋20倍，配制成100 mg/L的標準使用液，該溶液通過0.45 μm膜過濾，供HPLC測定。此溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX ODS C18（5 μm，4.6 mm×200 mm）；流動相：甲醇+36%乙酸+水（25+3+72）；流速：1 mL/min；等度洗脫；檢測波長：247 nm；柱溫：37 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.3 樣品的制備

將納豆膠囊脫去外殼，膠囊粉取出混勻，精密稱取25 mg樣品于25 mL容量瓶中，加入約15 mL體積分數(shù)70%的甲醇水溶液，超聲提取20 min后用甲醇水溶液定容混勻，靜置5 min，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液供高效液相色譜（HPLC）分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 提取溶劑的選擇

由于納豆膠囊的劑型復(fù)雜，而且大部分又為復(fù)合組方，成分復(fù)雜。根據(jù)葛根素易溶于甲醇、水等極性溶劑的特性，采用不同體積分數(shù)的甲醇/水溶液超聲提取，提取液經(jīng)0.45 μm水相膜過濾，實驗發(fā)現(xiàn)，體積分數(shù)70%的甲醇更能使葛根素提取完全，在除去蛋白質(zhì)、脂肪等雜質(zhì)，減少測定干擾方面效果很好，以此作為提取溶劑的樣品譜峰干凈，無雜質(zhì)干擾，故選用體積分數(shù)70%的甲醇為樣品提取溶劑。

2.1.2 檢測波長的選擇

根據(jù)現(xiàn)有文獻[2，5-6]，葛根素分別在波長239 nm、250 nm、247 nm處有較大紫外吸收，在此基礎(chǔ)上，以現(xiàn)有的儀器條件試驗了以上3個波長條件下葛根素的響應(yīng)值，確定在波長247 nm處葛根素有最大吸收。

2.1.3 流動相的選擇

分別比較了“甲醇-水”和“甲醇-36%乙酸-水”中性和酸性兩種流動相系統(tǒng)[7-10]，研究表明流動相為甲醇-36%乙酸-水（25∶3∶72）時，色譜峰形較好，保留時間適中，在此條件下葛根素的出峰時間為17.819 min，通過與標準的色譜圖對照，樣品中待測組分的色譜圖與標準的色譜圖匹配性很好，完全可以達到將待測組分與雜質(zhì)峰完全分離的目的（見圖1），滿足分析的要求。

圖1 葛根素標準溶液(a)，樣品(b)，樣品加標(c)色譜圖Fig.1 Chromatogram of puerarin standard solution (a),sample (b)and sample standard addition (c)

2.2 線性關(guān)系和靈敏度

將標準貯備液以體積分數(shù)70%的甲醇為溶劑適當(dāng)稀釋，配制成系列濃度梯度的標準溶液，在1.3.3條件下依次測定，以峰面積（y）為縱坐標，質(zhì)量濃度（x）為橫坐標繪制標準曲線，進行線性回歸分析。其線性范圍為0～1 000.0 mg/L，回歸方程為y=70 364x+297 207，相關(guān)性系數(shù)R2為0.999 4，并以3倍信噪比，得出方法檢出限為4.5 mg/kg。結(jié)果表明線性良好，靈敏度較高（見圖2）。

圖2 葛根素標準曲線Fig.2 Standard curve of puerarin

2.3 精密度與回收率

精密稱取同一樣品6份，用上述方法處理、測定，葛根素含量分別為22.5 mg/g、21.8 mg/g、23.1 mg/g、22.9 mg/g、23.7 mg/g、21.4 mg/g，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為3.8%。分別選取納豆膠囊樣品，添加10 mg/g、20 mg/g、30 mg/g三個質(zhì)量濃度的葛根素標準溶液，按本方法進行測定，結(jié)果（表1）表明，3個濃度的樣品加標回收率分別為96.6%～104.3%、103.2%～106.4%、97.5%～105.2%。本方法的準確度及精密度能滿足納豆膠囊中葛根素的分析要求。

表1 納豆膠囊樣品中葛根素的加標回收率Table 1 Recoveries of puerarin in the natto capsule

2.4 樣品的檢測與分析

按所建方法對統(tǒng)一品牌5個批次樣品進行檢驗，計算葛根素含量，結(jié)果見表2。從表2可以看出，該產(chǎn)品葛根素含量穩(wěn)定在22.2～23.6 mg/g。

表2 納豆膠囊中的葛根素含量Table 2 Puerarin content in natto capsule

3 結(jié)論

在該方法條件下葛根素含量在0～1 000 mg/L范圍內(nèi)線性較好，R2=0.999 4。本方法在10 mg/g、20 mg/g、30 mg/g三個含量的樣品加標回收率分別為96.6%～104.3%、103.2%～106.4%、97.5%～105.2%，檢出限為0.005 mg/g，本方法前處理簡便、準確度、精密度、回收率高、選擇性好、分離速度較快，能夠達到保健食品中功效成分的測定要求，經(jīng)分批抽樣檢測葛根素含量符合要求，該方法可以用于納豆膠囊中葛根素含量的測定。

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