孫 棣，馮永渝，梁桂娟

（貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州 貴陽(yáng) 550004）

我國(guó)白酒有幾千年的歷史，在酒類產(chǎn)品中，白酒行業(yè)所創(chuàng)造的效益一直名列前茅，并帶動(dòng)了相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。通過(guò)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，白酒中甜味劑的使用不是偶然情況，在白酒中加入甜味劑以增加白酒的甜味和回甜感，改善口感已成為白酒行業(yè)的潛規(guī)則。目前，廣泛應(yīng)用的人工合成甜味劑主要包括甜蜜素、阿斯巴甜、糖精鈉、安賽蜜等，甜味劑是人工合成的非發(fā)酵物質(zhì)，各香型白酒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定不得添加甜味劑[1-5]。

目前食品中檢測(cè)甜味劑的方法主要有氣相色譜法（gas chromatographic，GC）[6-8]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[9-13]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）[14-16]等。國(guó)標(biāo)中甜味劑的檢測(cè)方法主要是氣相色譜法和高效液相色譜法，但這些方法檢測(cè)限高，且國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.97—2003《食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測(cè)定》甜蜜素的檢測(cè)方法因易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果已被衛(wèi)生部監(jiān)督司列入不適合白酒檢測(cè)范圍。在實(shí)際監(jiān)測(cè)工作中發(fā)現(xiàn)，微量甚至痕量的甜味劑即可改善白酒的口感，而傳統(tǒng)的色譜法并不能有效地對(duì)白酒中的微量甜味劑進(jìn)行監(jiān)控。

為了找到對(duì)白酒中幾種甜味劑的檢出限和適宜的本底值，明確判定準(zhǔn)則，分清產(chǎn)品因素、人為因素和環(huán)境因素所帶來(lái)的影響，本研究建立了快速、靈敏、準(zhǔn)確的同時(shí)檢測(cè)白酒中4種甜味劑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測(cè)方法，并進(jìn)行了大量白酒樣品中甜味劑的檢測(cè)，對(duì)白酒生產(chǎn)過(guò)程中的甜味劑產(chǎn)生的可能原因進(jìn)行了分析，為食品安全監(jiān)管工作提供技術(shù)支持，保障白酒的食品安全和質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原酒、成品酒、曲藥、香料：生產(chǎn)企業(yè)庫(kù)房抽??；安賽蜜、甜蜜素、糖精鈉、三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞98.5%）：德國(guó)Dr.Ehrensforfer GmbH公司；甲醇（色譜純）、乙酸銨（色譜純）：德國(guó)Merck公司；0.22 μm微孔濾膜：上海信步科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

4000QTRAP三重四極桿質(zhì)譜儀：美國(guó)AB Sciex公司；Agillent1260高效液相色譜儀：美國(guó)Agillent公司；N60M氮?dú)獍l(fā)生器：美國(guó)PEAK公司；UVS-1振蕩混勻器：德國(guó)Heielolph公司；Milli-Q Academic超純水系統(tǒng)：密理博（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液和使用溶液的配制

精確稱取安賽蜜、甜蜜素、糖精鈉、三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0 g，用超純水溶解后定容至100 mL容量瓶中，制備成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃保存。

將上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，用超純水配制質(zhì)量濃度分別為5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

1.3.2 樣品前處理

酒樣（液體樣品）：取2.0 g樣品，置于25 mL比色管中，加入20 mL蒸餾水渦旋混勻后，用水定容至刻度，混勻后過(guò)0.22 μm微孔濾膜待測(cè)。

曲藥、香料（固體樣品）：取2.0 g樣品，置于25 mL比色管中，加入20 mL蒸餾水渦旋混勻后超聲提取30 min，取出放至室溫后用水定容至刻度，混勻后濾紙過(guò)濾，將濾液過(guò)0.22 μm微孔濾膜后進(jìn)樣測(cè)定。

1.3.3 儀器條件

質(zhì)譜條件：電噴霧（electronic spray ion，ESI）離子源；采用負(fù)離子模式；離子監(jiān)測(cè)采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式；電噴霧電壓（spray voltage，SV）5 500 V，噴霧氣（GS1）、輔助氣（GS2）、氣簾氣（CUR）流速分別為60 L/h、60 L/h、35 L/h。噴霧氣溫度為650 ℃。定性、定量離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞電壓等參數(shù)見表1。

表1 MRM監(jiān)測(cè)模式的優(yōu)化條件Table 1 The optimum conditions of MRM mode

高效液相色譜條件：色譜柱Agillent EC-C18（3.0 mm×50 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相為0.01 mol/L乙酸銨水溶液/甲醇；梯度洗脫，具體條件見表2；流速0.8 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions of mobile phase

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的確定

參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1948—2007《進(jìn)出口食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測(cè)定》中前處理方法，取酒樣直接進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)回收率只有30%左右，這可能是因?yàn)榫茦又泻芯凭任镔|(zhì)產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)，從而引起回收率偏低?？紤]到白酒樣品本身的基質(zhì)效應(yīng)，取酒樣在水浴鍋上揮干，用純水定容進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)回收率達(dá)到90%以上，也證實(shí)了酒樣的基質(zhì)效應(yīng)，但該法在揮干酒精的過(guò)程中耗時(shí)較長(zhǎng)，步驟繁瑣，后來(lái)對(duì)方法進(jìn)行了改進(jìn)，通過(guò)直接用超純水稀釋10倍后進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)該方法回收率為95%左右，大大降低了白酒的基質(zhì)效應(yīng)、方法簡(jiǎn)便快速。

對(duì)于曲藥，香料等固體物質(zhì)采用超聲法將水溶性甜味劑提取到水溶液中，通過(guò)過(guò)濾凈化后進(jìn)樣，方法簡(jiǎn)便，回收率＞90%，適用于固體樣品中甜味劑的前處理。

2.2 色譜條件的選擇

從不同流動(dòng)相對(duì)待測(cè)物質(zhì)在色譜柱上的分離度、峰形、靈敏度和保留時(shí)間等的影響為考察指標(biāo)，對(duì)水-甲醇體系和乙酸銨-甲醇體系進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸銨-甲醇體系分離4種甜味劑時(shí)分離度、峰形、靈敏度以及保留時(shí)間的穩(wěn)定性均優(yōu)于水-甲醇體系。這是由于乙酸銨是緩沖溶液，可提高待測(cè)物質(zhì)的離子化效率，同時(shí)又可作為離子對(duì)試劑提高待測(cè)物質(zhì)在反相色譜柱上的保留時(shí)間，從而改善其在液相色譜中的保留行為[17]。因此本試驗(yàn)選擇乙酸銨-甲醇體系作為流動(dòng)相。4種物質(zhì)的色譜圖如圖1所示。

圖1 四種甜味劑的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of the four kinds of sweeteners

由圖1可知，經(jīng)過(guò)色譜條件的優(yōu)化，4種物質(zhì)峰型尖銳對(duì)稱、靈敏度高、專屬性強(qiáng)，且在6 min內(nèi)可以完成全部物質(zhì)的同時(shí)測(cè)定，因此該方法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。各物質(zhì)的MRM色譜圖見圖2。由圖2可知，4種甜味劑在Agillent EC-C18上有較好保留，且峰形對(duì)稱。

圖2 安賽蜜(A)、糖精鈉(B)、甜蜜素(C)、三氯蔗糖(D)的MRM色譜圖Fig.2 Multiple reactions monitoring chromatograms of acesulfame(A),saccharin sodium (B),sodium cyclamate (C) and sucralose (D)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限

配制5ng/mL、10 ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。并根據(jù)信噪比S/N=3確定了4種甜味劑的檢出限，結(jié)果如表3所示。

表3 4種甜味劑的線性方程及檢出限Table 3 Linear equation and detection limits of the four kinds of sweeteners

從表3中可以看出，4種化合物在5～100 ng/mL線性范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.998 6，檢出限達(dá)到10-9級(jí)，方法靈敏度高。

2.4 方法的精密度和回收率試驗(yàn)

向白酒樣品中分別添加4種甜味劑的高（50 ng/mL）、中（10 ng/mL）、低（5 ng/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行精密度和回收率試驗(yàn)，將每個(gè)質(zhì)量濃度樣品平行測(cè)定6次，測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 4種甜味劑的加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 4 Recovery rates and precision test results of four sweeteners (n=6)

由表4可知，4種甜味劑的物質(zhì)在高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度水平的精密度試驗(yàn)中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.09%～4.64%，表明結(jié)果精密度良好，回收率在82.7%～117.62%，表明結(jié)果準(zhǔn)確度高。結(jié)果表明，該方法能夠滿足白酒中安賽蜜、甜蜜素、糖精鈉、三氯蔗糖4種甜味劑的檢測(cè)需要。

2.5 不同樣品中甜味劑的檢測(cè)結(jié)果及其來(lái)源分析

應(yīng)用本方法對(duì)成品酒、自產(chǎn)輪次酒、基酒、外購(gòu)基酒、外購(gòu)調(diào)味酒、自產(chǎn)曲藥、外購(gòu)糖化酶等22個(gè)批次樣品進(jìn)行了跟蹤檢驗(yàn)排查，結(jié)果見表5。

表5 樣品中4種甜味劑的檢測(cè)結(jié)果Table 5 Determination results of four sweeteners in samples mg/kg

由表5可知，企業(yè)自身生產(chǎn)的成品酒、輪次酒及生產(chǎn)所用到曲藥和糖化酶的甜味劑檢出量非常低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢出限（甜蜜素0.1 mg/kg、糖精鈉1.0 mg/kg、安賽蜜4.0 mg/kg、三氯蔗糖4.0 mg/kg），企業(yè)按照正常工藝生產(chǎn)，甜味劑的本底值是很低的，不存在誤判風(fēng)險(xiǎn)。

發(fā)現(xiàn)其外購(gòu)的調(diào)味酒含有較高的甜味劑，其中甜蜜素含量為810.68 mg/kg，糖精鈉為405.34 mg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢出限，從而導(dǎo)致成品酒中的甜味劑含量超標(biāo)。

本研究針對(duì)調(diào)味酒進(jìn)行檢測(cè)，在本省獲證白酒企業(yè)抽取調(diào)味酒13個(gè)批次進(jìn)行追蹤檢驗(yàn)，其中11個(gè)批次調(diào)味酒檢出甜味劑，甜蜜素檢出11個(gè)，其中7個(gè)超過(guò)0.1 mg/kg的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢出限，糖精鈉檢出11個(gè)，其中1個(gè)超過(guò)1.0 mg/kg的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢出限；安賽蜜檢出3個(gè)，其中1個(gè)超過(guò)4.0 mg/kg的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢出限；三氯蔗糖檢出1個(gè)，沒(méi)有超過(guò)4.0 mg/kg的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢出限，這也表明調(diào)味酒是帶入白酒甜味劑的主要原因，外購(gòu)調(diào)味酒是造成成品酒甜味劑超標(biāo)的較大的風(fēng)險(xiǎn)源。

對(duì)濃香型白酒及醬香型白酒的自產(chǎn)新酒樣、組合基酒、盤勾酒樣、醬香醇甜酒、待裝成品酒樣、典型成品酒樣、自產(chǎn)高溫大曲、中溫大曲等41個(gè)樣品進(jìn)行檢驗(yàn)排查，所有酒樣均未檢出甜味劑，在高溫大曲、中溫大曲中均檢出甜蜜素含量為0.03 mg/kg左右，其他甜味劑均低于方法檢出限。

對(duì)其他獲證企業(yè)自產(chǎn)或外購(gòu)糖化酶采樣23個(gè)批次，進(jìn)行了4種甜味劑的檢測(cè)，均檢出的低含量的甜蜜素和糖精鈉，其中，曲藥中甜蜜素檢測(cè)范圍在0.031～0.10 mg/kg，糖精鈉檢測(cè)范圍在0.007～0.040 mg/kg，這可能是曲藥在自身的發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生干擾物質(zhì)，從而導(dǎo)致成品酒中甜味劑本底值的產(chǎn)生。但曲藥和成品酒的檢出值均低于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1948—2007《進(jìn)出口食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測(cè)定》規(guī)定的0.1 mg/kg的檢出限。

采用本方法對(duì)市售可能添加到白酒中的10個(gè)香料物質(zhì)進(jìn)行4種甜味劑的檢測(cè)，香料中4種甜味劑均未檢出。白酒生產(chǎn)中按固態(tài)發(fā)酵工藝生產(chǎn)不會(huì)引起甜味劑超標(biāo)，但是通過(guò)外購(gòu)基酒調(diào)味酒的方式卻會(huì)增大甜味劑檢出的風(fēng)險(xiǎn)，企業(yè)應(yīng)采取有效手段對(duì)外購(gòu)酒樣的質(zhì)量進(jìn)行控制，以保證白酒生產(chǎn)質(zhì)量安全[18]。

3 總結(jié)

本研究建立了同時(shí)、快速檢測(cè)白酒及曲藥中安賽蜜、甜蜜素、糖精鈉、三氯蔗糖等4種甜味劑含量的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法。白酒樣品經(jīng)過(guò)超純水稀釋10倍后直接進(jìn)樣，采用甲醇-乙酸銨溶液為流動(dòng)相進(jìn)行檢測(cè)，4種甜味劑在6 min內(nèi)可達(dá)到完全分離，在5～100 ng/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（相關(guān)系數(shù)R2≥0.998 6），檢出限為0.005～0.02 mg/kg，回收率為82.7%～117.62%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.09%～4.64%，表明該方法靈敏度高、精密度及準(zhǔn)確性良好。同時(shí)通過(guò)對(duì)白酒生產(chǎn)工藝的整個(gè)流程進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)曲藥在自身的發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生類似甜蜜素的干擾物質(zhì)，從而導(dǎo)致成品酒中檢出微量甜蜜素。結(jié)果表明，該檢測(cè)方法快速靈敏，大大縮短了檢測(cè)周期和檢測(cè)成本，能夠及時(shí)為質(zhì)監(jiān)部門提供執(zhí)法的科學(xué)依據(jù)。

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