王黎，王文娟，高蘇亞

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

竹節(jié)參別名竹節(jié)三七、竹節(jié)人參、竹根七等，為五加科人參屬植物竹節(jié)參Panax japonicus C. A.Mey.的干燥根莖，始載于《本草綱目拾遺》，是人參屬當(dāng)中的一野生品種，民間將蒸熟的肉質(zhì)根作滋補(bǔ)藥，生曬根莖作止血藥具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、散瘀止痛、止血祛痰等功效，臨床上常用于病后虛弱、勞嗽咳血、跌打損傷等［1-2］。其化學(xué)成分以皂苷類為主，齊敦果酸為主要苷元［3］。目前，中國藥典收載該藥還未有含量測(cè)定項(xiàng)，僅對(duì)有效成分進(jìn)行了薄層色譜鑒別。本文采用反相高效液相色譜法對(duì)竹節(jié)參中皂苷類成分齊敦果酸的含量進(jìn)行快速測(cè)定，為竹節(jié)參藥材的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供了一定依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料與儀器

齊敦果酸對(duì)照品(98%);竹節(jié)參藥材(產(chǎn)地云南)，經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院生藥教研室馮永輝副教授鑒定為正品竹節(jié)參Panax japonicus C.A.Mey;甲醇，色譜純;水為三重蒸餾水。

P-680 型高效液相色譜儀;UV-170 型紫外檢測(cè)器;BSA224S-CW 型電子天平;SB-5200DT 型超聲波清洗機(jī)。

1.2 溶液的制備

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定齊敦果酸對(duì)照品2.36 mg 于2 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成1.18 mg/mL 對(duì)照品溶液，0.45 μm 微孔濾膜過濾，制備對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備［4］精密稱取干燥后的竹節(jié)參藥材粉末1.0 g，以研缽研為粉末后，過60 目篩，置于具塞錐形瓶中，向其中加入50 mL 甲醇，稱定重量，于功率250 W，頻率50 kHz 的超聲中放置40 min，稱定后用甲醇補(bǔ)足所減失重量，搖勻，濾過;精密量取續(xù)濾液10 mL，回收溶劑至干，加25%鹽酸20 mL、三氯甲烷25 mL 至殘?jiān)?，加熱水?.0 h，再用三氯甲烷振搖提取2 次，每次25 mL，合并提取液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱為Kromasil C18柱(150 mm ×4. 6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水(93 ∶7)，檢測(cè)波長為215 nm，流速為1.0 mL/min，理論塔板數(shù)以齊墩果酸色譜峰計(jì)不低于5 000，見圖1。

圖1 反相高效液相色譜圖Fig.1 RP-HPLC chromatogram

2.2 線性實(shí)驗(yàn)

精密吸取齊墩果酸對(duì)照品溶液2，4，6，8，10，15，20 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積值，以峰面積積分值的常用對(duì)數(shù)(lgY)為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量的常用對(duì)數(shù)(lgX)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析(Y=7.415 7X－0.811 5，r=0.999 8)，結(jié)果表明，齊墩果酸在2.36 ～23.60 μg/mL 范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取齊敦果酸對(duì)照品溶液，按上述色譜條件以進(jìn)樣量20 μL 重復(fù)進(jìn)樣6 次，取得齊墩果酸峰面積測(cè)定結(jié)果平均值為117.612，RSD 為1.00%。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取竹節(jié)參供試品溶液，分別放置于0，2，4，6，8 h按上述色譜條件進(jìn)樣10 μL 進(jìn)行測(cè)定，齊敦果酸峰面積的RSD 為0.91%，表明該樣品溶液在8 h 內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一批待測(cè)竹節(jié)參藥材粉末5 份，分別按1.2.2 節(jié)方法制備為供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣10 μL 進(jìn)行測(cè)定，所得齊敦果酸峰面積的RSD 為0.63%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱定竹節(jié)參藥材粉末0.2 g(已知齊墩果酸含量48.28 mg/g)6 份，分別按已知含量的80%，100%，120%加入齊墩果酸對(duì)照品溶液，按1.2.2 節(jié)方法制備樣品溶液并測(cè)定，計(jì)算得齊墩果酸平均回收率為98.86%，RSD 為0.41%，結(jié)果見表1。

表1 竹節(jié)參中齊墩果酸回收率實(shí)驗(yàn)(n=6)Table 1 Recoveries of Oleanolic acid in Panax japonicus

2.7 樣品含量測(cè)定

取竹節(jié)參藥材待測(cè)樣品按1.2.2 節(jié)方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣20 μL 進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果表明該產(chǎn)地云南的竹節(jié)參藥材中齊墩果酸平均含量為48. 277 mg/g，結(jié)果見表2。

表2 待測(cè)云南產(chǎn)竹節(jié)參中齊墩果酸含量測(cè)定結(jié)果Table 2 The assay results of Oleanolic acid in Panax japonicus

3 討論

3.1 檢測(cè)波長的優(yōu)化

采用UV 檢測(cè)器對(duì)齊墩果酸對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長掃描，在210 nm 處出現(xiàn)最大吸收，但210 nm 檢測(cè)時(shí)基線不平穩(wěn)、溶劑峰干擾大、檢測(cè)器響應(yīng)值小。為了優(yōu)化檢測(cè)效果、減少干擾、提高信噪比，選擇在215 nm 處檢測(cè)，基線平穩(wěn)且峰形滿意。

3.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

分別以甲醇-0.2%乙酸水溶液、甲醇-1%乙酸水溶液、甲醇-0.2%磷酸水溶液、甲醇-水為流動(dòng)相來進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果此四種流動(dòng)相體系所得的峰對(duì)稱度較差，然后將其中的甲醇改為乙腈，當(dāng)選用乙腈-水的流動(dòng)相體系時(shí)，峰形較好。以乙腈-水的體積比分別為86∶14、88∶12、90∶10、93∶7 作流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相比例為86∶14 時(shí)峰形對(duì)稱度較差，88∶12 時(shí)對(duì)照品后有一小峰且無法分開，90∶10 時(shí)峰形對(duì)稱度有所改善但保留時(shí)間不夠穩(wěn)定(在6.0 ～7.5 min 之間波動(dòng))，93∶7 時(shí)不僅峰形對(duì)稱度高且分離效果較好、基線平穩(wěn)，故將最終的流動(dòng)相確定為乙腈-水(93∶7)。

4 結(jié)論

本文建立了以高效液相色譜法測(cè)定竹節(jié)參中三萜苷元齊墩果酸含量的方法，系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)表明選擇乙腈-水的流動(dòng)相體系符合中藥材主要成分含量測(cè)定的要求;方法學(xué)考察表明該法快速準(zhǔn)確、簡單易行、重現(xiàn)性好，為竹節(jié)參藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了一定依據(jù)。

［1］ 王慧清. 中藥材產(chǎn)銷［M］. 成都:四川科學(xué)技術(shù)出版社，2004:320-322.

［2］ 國家藥典委員會(huì).中國藥典2005 年版［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:93.

［3］ 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì). 中華本草［M］.第五卷.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999:832-834.

［4］ 袁丁，何毓敏，魯科明，等. 中藥竹節(jié)參中總皂苷和齊墩果酸的含量測(cè)定［J］. 西北藥學(xué)雜志，2008，23(5):279-280.