劉海龍，黎妍妍，，鄭　露，李錫宏，黃俊斌*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院，湖北省作物病害監(jiān)測(cè)和安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢 430030）

湖北地區(qū)煙草青枯菌系統(tǒng)發(fā)育分析

劉海龍1，黎妍妍1，2，鄭露1，李錫宏2，黃俊斌1*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院，湖北省作物病害監(jiān)測(cè)和安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢 430030）

摘要：本研究采用青枯菌演化型分類框架，對(duì)來(lái)源于湖北煙區(qū)的48個(gè)煙草青枯菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析并進(jìn)行序列變種鑒定，以明確該地區(qū)煙草青枯菌的菌系分化?；谇嗫菥鷥?nèi)切葡聚糖酶基因（egl）和DNA蛋白修復(fù)基因（mutS）的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果表明，48個(gè)供試菌株屬于青枯菌亞洲分支（演化型Ⅰ）的3個(gè)序列變種，分別為序列變種15、17和44，未發(fā)現(xiàn)我國(guó)已報(bào)道的煙草青枯菌序列變種34。其中序列變種17和44為優(yōu)勢(shì)菌系，且均來(lái)源于恩施地區(qū)；序列變種15只包含來(lái)源于十堰地區(qū)的3個(gè)菌株。本研究表明湖北地區(qū)煙草上的青枯菌存在一定程度的遺傳分化。

關(guān)鍵詞：煙草；青枯菌；序列變種；內(nèi)切葡聚糖酶基因；DNA修復(fù)蛋白基因

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的危害世界煙葉生產(chǎn)的重要土傳病害，1864年在印度尼西亞首次報(bào)道了青枯菌對(duì)煙草的毀滅性危害［1］。1940年前后，該病在美國(guó)的北卡羅來(lái)納州猖獗危害，此后，又逐漸成為日本、澳大利亞、韓國(guó)等許多產(chǎn)煙國(guó)家煙草上重要病害［2］。煙草青枯病在我國(guó)長(zhǎng)江流域及其以南煙區(qū)普遍發(fā)生，其中尤以福建、貴州、云南、湖南及廣西煙區(qū)危害最為嚴(yán)重［3］。近年來(lái)，該病逐漸向北方煙區(qū)擴(kuò)展蔓延，遼寧、河南及陜西等省均有該病發(fā)生的報(bào)道［4-5］。

傳統(tǒng)的分類框架是根據(jù)青枯菌的寄主范圍或?qū)?種雙糖和3種己醇的利用能力將其劃分為5個(gè)生理小種（race1，2，3，4和5）或6個(gè)生化型（biovarⅠ，ⅡA ，ⅡT，Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ）［6-7］。2005年，F(xiàn)egan等［8］提出了新的青枯菌劃分框架，將青枯菌依次劃分為種（Species）、演化型（Phylotype）、序列變種（Sequevar）和克隆（Clone）4個(gè)分類水平，并分別建立了與之相對(duì)應(yīng)的鑒定方法。其中演化型的劃分與青枯菌地理起源緊密相關(guān)，即演化型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。基于青枯菌內(nèi)切葡聚糖酶基因（egl）和DNA修復(fù)蛋白基因（mutS），每一個(gè)演化型又可劃分為不同的序列變種，目前青枯菌已劃分出53個(gè)序列變種［9-10］。

我國(guó)對(duì)煙草青枯病菌菌系的研究大多以傳統(tǒng)的生理小種和生化型測(cè)定為主，而應(yīng)用最新的演化型分類框架對(duì)煙草青枯菌的菌系分化研究較少。鄭向華等［11］采用RAPD法對(duì)廣東省煙草青枯病菌的遺傳多樣性進(jìn)行了研究；Xu等［12］和潘哲超等［13］采用演化型分類框架對(duì)福建及貴州等地的62個(gè)煙草青枯菌菌株進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。近年來(lái)，隨著湖北煙草生產(chǎn)的不斷發(fā)展，煙草青枯病的發(fā)生也日趨嚴(yán)重，本研究在湖北恩施地區(qū)的煙草青枯菌進(jìn)行了生理分化研究的基礎(chǔ)上［14］，采用國(guó)際最新的青枯菌演化型分類框架，對(duì)湖北省青枯病危害較重?zé)焻^(qū)的煙草青枯菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析并進(jìn)行序列變種鑒定，為湖北地區(qū)青枯病的防控工作及煙草的抗青枯病育種提供理論基礎(chǔ)。

1　 材料與方法

1.1 供試菌株

2013年和2014年分別從湖北省恩施州和十堰市的12個(gè)種煙鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集分離煙草青枯菌株，共獲得48個(gè)煙草青枯菌株。供試菌株和參考菌株見(jiàn)表1。

1.2供試菌株egl基因的擴(kuò)增

選用MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction試劑盒（ver3.0，大連寶生物工程有限公司）提取48個(gè)供試菌株基因組DNA，以此DNA為模板，對(duì)供試菌株的egl基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

用于擴(kuò)增內(nèi)切葡聚糖酶（egl）基因的引物為：Endo-F（5'-ATGCATGCCGCTGGTCGCCGC-3）和Endo-R（5'-GCGTTGCCCGGCACGAACACC-3'）［15］。PCR擴(kuò)增采用25 μL反應(yīng)體系，其中包括2×Es Taq MasterMix 12.5 μL，引物Endo-F和Endo-R各1 μL，DNA 50ng，RNase-Free水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?6 ℃ 9 min；95 ℃ 1 min，64 ℃ 1 min和72 ℃2 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后交由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司測(cè)序。

1.3供試菌株mutS基因的擴(kuò)增

用于擴(kuò)增青枯菌DNA修復(fù)蛋白（mutS）基因的引物為：mutS-RsF.1570（5'-ACAGCGCCTTGAG CCGGTACA-3'）和mutS-RsR.19265'-GCTGA TCACCGGCCCGAACAT -3'）［16］。PCR擴(kuò)增采用25μL反應(yīng)體系，其中包括2×Es Taq MasterMix 12.5μL，引物mutS-RsF.1570水補(bǔ)足25μL。反應(yīng)程序?yàn)?6℃ 9min；95℃30 s，60 ℃30 s和72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后交由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 供試菌株的序列分析

將測(cè)序獲得的48個(gè)菌株的egl和mutS基因序列經(jīng)BioEdit7.2.5軟件［13］編輯后，提交給GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)見(jiàn)表1。然后應(yīng)用Clustal W軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，用MEGA6.0.5（http：//www.megasoftware.net/）軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法（NJ）構(gòu)建發(fā)育樹(shù)，自舉分析為1000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)得到的自舉置信度。從GenBank選取17個(gè)已確定序列變種歸屬的參考菌株序列作為參考，以確定供試菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中的位置。

2　 結(jié)果

2.1青枯菌egl基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

對(duì)來(lái)源于湖北地區(qū)煙草青枯病菌的egl基因部分序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，所有48個(gè)參試菌株分布于亞洲分支（演化性Ⅰ）下的3個(gè)亞組內(nèi)（圖1）。采用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列變種的標(biāo)準(zhǔn)菌株序列作為參照，3個(gè)亞組分別被鑒定為序列變種15、17和44。其中序列變種15以我國(guó)臺(tái)灣的番茄青枯菌菌株P(guān)ss358為參考，該序列變種僅包括3個(gè)來(lái)源于十堰煙區(qū)的分離菌株，寄主品種為‘云煙87’；以來(lái)源于廣西花生青枯菌菌株P(guān)11作為標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列邊變種17，包括19個(gè)菌株，分別來(lái)源于恩施煙區(qū)的宣恩、利川、咸豐、鶴峰、建始5縣，寄主品種為‘畢納1號(hào)’、‘云煙87’、‘K326’以及‘鄂煙1號(hào)’；序列變種44的標(biāo)準(zhǔn)菌株為我國(guó)廣東油橄欖青枯菌菌株O3，該序列變種包括26個(gè)菌株，分別來(lái)源于恩施煙區(qū)的宣恩、利川、咸豐、建始、來(lái)鳳、恩施6個(gè)縣市，分離寄主品種為‘云煙87’、‘畢納1號(hào)’和‘鄂煙1號(hào)’。

表1　供試煙草青枯菌及上傳到基因數(shù)據(jù)庫(kù)的基因序列Table1　Ralstonia solanacearum strains used in this study and gene sequences deposited in GenBank

2.2青枯菌mutS基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

通過(guò)對(duì)48個(gè)參試菌株的mutS基因部分序列系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果表明，所有菌株分布于亞洲分支（演化性Ⅰ）下的2個(gè)亞組內(nèi)（圖2）。其中亞組1包含的菌株相當(dāng)于由egl基因劃分的序列變種44，而亞組2包含的菌株相當(dāng)于由egl基因的序列變種15和序列變種17。

圖1　基于青枯菌egl基因部分序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖2基于mutS基因部分序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1　Phylogenetic tree on partial sequences of Fig.2Phylogenetic tree on partial sequences of endoglucanase （egl） gene from Ralstonia solanacearummutSgene from Ralstonia solanacearum

3　討論

青枯菌寄主范圍廣泛，能夠侵染超過(guò)50個(gè)科的450種植物，不同地理來(lái)源的青枯菌在與其寄主長(zhǎng)期演化過(guò)程中，表現(xiàn)出明顯的生理分化和遺傳多樣性［12］。

煙草青枯病是美國(guó)東南部地區(qū)煙草生產(chǎn)上的主要病害，Hong等［17］基于Fegan和Prior提出的演化型分類框架，對(duì)該地區(qū)的煙草青枯菌進(jìn)行了遺傳多樣性研究，結(jié)果表明，該地區(qū)煙草青枯菌屬于美洲分支（演化性Ⅱ）的序列變種7。目前我國(guó)有22個(gè)植煙區(qū)，煙草青枯病在其中16個(gè)主要產(chǎn)煙區(qū)普遍發(fā)生，潘哲超等［13］采用演化型分類框架，首次對(duì)來(lái)自我國(guó)福建、貴州、廣東和廣西地區(qū)的煙草青枯菌進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，我國(guó)煙草青枯菌存在演化性Ⅰ的4個(gè)序列變種，即序列變種15，17，34和44，其中來(lái)源于福建的菌株屬于序列變種34，而來(lái)源于貴州的菌株均屬于序列變種17。在此基礎(chǔ)上，本研究采用該分類框架，對(duì)分離自湖北省恩施和十堰煙區(qū)的48個(gè)煙草青枯菌，基于其egl基因的部分序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析和序列變種鑒定。鑒定結(jié)果表明，48個(gè)供試菌株全部屬于演化性Ⅰ中的3個(gè)序列變種，即序列變種15、17和44，尚未發(fā)現(xiàn)在我國(guó)已報(bào)道的煙草青枯菌序列變種34。其中序列變種17和44無(wú)一例外全部來(lái)自恩施煙區(qū)，而且分離自同一縣市不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的煙草青枯菌也可能分屬于不同的序列變種，如宣恩縣、咸豐縣、利川市和建始縣既存在煙草青枯菌序列變種17又有序列變種44，而分離自十堰煙區(qū)的菌株則均屬于序列變種15。但由于本研究采集的菌株數(shù)目有限，因此，在湖北煙區(qū)除了序列變種15、17和44，是否還存在其他序列變種，十堰煙區(qū)除了序列變種15是否還有其他序列變種，還需進(jìn)一步研究；而分布于我國(guó)的煙草青枯菌，除了已報(bào)到的4個(gè)序列變種，是否還存在其他序列變種，以及各序列變種與國(guó)內(nèi)省份或地區(qū)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，也需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。另外，本研究還采用青枯菌mutS基因的部分序列對(duì)48個(gè)供試菌株進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，48個(gè)菌株被劃分為亞洲分支下的2個(gè)亞組，其中亞組1相當(dāng)于egl基因的序列變種44，包括26個(gè)菌株，其均來(lái)自于恩施煙區(qū)；而亞組2相當(dāng)于egl基因的序列變種15和序列變種17，包括3個(gè)來(lái)源于十堰煙區(qū)和19個(gè)來(lái)源于恩施煙區(qū)的菌株。

4　結(jié)論

本研究采用Fegan和Prior提出的青枯菌演化型分類框架，對(duì)來(lái)源于湖北煙區(qū)的48個(gè)煙草青枯菌，進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析和序列變種鑒定。鑒定結(jié)果表明，分布于湖北煙區(qū)的煙草青枯菌屬于3個(gè)序列變種，即序列變種15、17和44。其中序列變種17和44為優(yōu)勢(shì)變種，且均來(lái)源于恩施煙區(qū)；序列變種15均來(lái)源于十堰煙區(qū)。選育抗病品種是防治煙草青枯病的重要措施，但由于青枯菌群體高度適應(yīng)性和極強(qiáng)的變異性，使得抗青枯病煙草品種的選育和利用變得更為復(fù)雜困難。因此，弄清湖北省煙草青枯菌的序列變種及其地理分布，有利于從現(xiàn)有的煙草品種中篩選出抗青枯病品種，為該省抗病品種合理布局服務(wù)。

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中圖分類號(hào)：S572.08

文章編號(hào)：1007-5119（2015）02-0081-06

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2015.02.015

基金項(xiàng)目：中國(guó)煙草總公司湖北省公司重點(diǎn)項(xiàng)目（027Y2013-002）

作者簡(jiǎn)介：劉海龍，男，碩士生，從事植物細(xì)菌病害研究。E-mail：gsndliuhailong@126.com。*通信作者，E-mail：junbinhuang@mail.hzau.edu.cn

收稿日期：2015-01-05修回日期：2015-01-29

Phylogenetic Analysisof Tobacco Ralstonia solanacearum strains from Hubei Province

LIU Hailong1， LI Yanyan1，2， ZHENG Lu1， LI Xihong2， HUANG Junbin1*
（1. Key Laboratory of Plant Pathology of Hubei Province， College of Plant Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China； 2. Tobacco Research Academy of Hubei Province， Wuhan 430030， China）

Abstract:For further details physiological specialization of Ralstonia solanacearum strains isolated from Hubei Province，48R.solanacearum strains of tobacco were analyzed using the phylotype classification schemes. Phylogenetic analysis of endoglucanase gene（egl） and DNA mismatch repair protein gene（mutS） sequences showed that all isolates belonged to phylotypeⅠ，including 3 different sequevars15，17 and 44. 19 strains were belonged to sequevar 17 and 26 strains were belonged to sequevar 44，Only 3 strains were identified as sequevar15. R.solanacearum strains of tobacco from Hubei Province had genentic differentiation of sequevar level.

Keywords:tobacco； Ralstonia solanacearum； sequevar； egl； mutS