楊　靜，陳　杰，陳建軍，鄧世媛，邱妙文，趙偉才，王　維*

（1.黔東南州煙草公司鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣分公司，貴州鎮(zhèn)遠(yuǎn) 557700；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州 510642；3.黔東南州煙草公司，貴州凱里 556000；4.廣東省煙草南雄科學(xué)研究所，廣東南雄 512400）

烤煙品種K326及其耐低溫抗早花變異系基因表達(dá)譜分析

楊靜1，2，陳杰3，陳建軍2，鄧世媛2，邱妙文4，趙偉才4，王維2*

（1.黔東南州煙草公司鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣分公司，貴州鎮(zhèn)遠(yuǎn) 557700；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州 510642；3.黔東南州煙草公司，貴州凱里 556000；4.廣東省煙草南雄科學(xué)研究所，廣東南雄 512400）

摘要：為了解烤煙早花與抗早花的形成及調(diào)控機(jī)制，本研究利用安捷倫煙草全基因組芯片分析了烤煙品種K326及其抗早花品系華煙06莖尖端花芽分化過程中基因的表達(dá)。結(jié)果表明，K326與華煙06距離各自花芽分化相同時(shí)間的莖尖端未花芽分化時(shí)的差異探針數(shù)最多，有5295個(gè)；K326分化當(dāng)天各品種（品系）之間相比較差異探針數(shù)量最少，有2116個(gè)。與分子功能相關(guān)的差異基因主要與催化性能、轉(zhuǎn)運(yùn)性能、結(jié)合性能和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)性能有關(guān)；與細(xì)胞組成相關(guān)的差異基因主要是與細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞器相關(guān)的基因；與生物學(xué)過程相關(guān)的差異基因種類最多最復(fù)雜，涉及到植株抗逆性、生長、發(fā)育等方面，這對(duì)進(jìn)一步研究與從中搜尋與煙草開花相關(guān)的基因奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：烤煙；早花；抗早花；基因芯片；表達(dá)譜

煙草早花指植株未能達(dá)到正常生長應(yīng)具有的高度和葉數(shù)就現(xiàn)蕾開花。國內(nèi)外烤煙均存在煙草早花問題［1-2］，嚴(yán)重影響著煙葉的生產(chǎn)。近百年來，人們在開花生理生化方面進(jìn)行了大量的探索［3］，直到1990年，Yanofsky等［4］成功地分離了花器官發(fā)育控制基因AGAMOUS，植物發(fā)育生物學(xué)的機(jī)理研究由以生理生化為主轉(zhuǎn)變到以分子生物學(xué)及生理遺傳學(xué)為主。擬南芥開花基因的研究開啟了植物開花基因研究的大門，水稻、谷物、果樹中與開花相關(guān)的基因的研究也已取得了很大的進(jìn)展，與開花相關(guān)的

（http：//www.shanghaibiotech.com），利用在線SAS系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過GO（Gene Ontology）分析對(duì)兩倍以上的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和富集分析。

1.5熒光定量PCR驗(yàn)證

利用煙草Actin基因（AB158612）為內(nèi)參，從基因芯片分析結(jié)果中隨機(jī)挑選出5個(gè)與開花相關(guān)的基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，熒光定量PCR所用材料與基因芯片的材料及處理方式完全一樣。3次重復(fù)，反應(yīng)條件為95℃，10min；接著進(jìn)行40個(gè)循環(huán)：95℃，15秒；60℃，30 s。算法為log2 2-ΔΔ Ct。

表1　差異探針分析Table1　Analysis of differential probes

圖2　與分子功能及細(xì)胞組成相關(guān)的顯著富集基因Fig.2　Molecular function related and cellular component related significantly enriched genes

2　 結(jié)果

2.1 芯片數(shù)據(jù)驗(yàn)證

試驗(yàn)中K326于4月11日現(xiàn)蕾，華煙06于4月24日現(xiàn)蕾，二者現(xiàn)蕾時(shí)間相差13 d。為了驗(yàn)證芯片分析結(jié)果，隨機(jī)挑選了5個(gè)與開花有關(guān)并具有代表性的差異基因（CCR2，ELF4，AGL20，CBF1，COL9）進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果表示芯片表達(dá)譜信息具有較高的可靠性。

2.2芯片掃描結(jié)果中差異探針數(shù)的基本特征

按照兩倍以上（FC＞2或FC＜0.5）差異為有效差異的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異探針，將基因表達(dá)情況分別進(jìn)行縱向比較和橫向比較?？v向比較為K326和華煙06各自花芽分化過程中莖尖端基因表達(dá)情況的比較；橫向比較包括：K326和華煙06距離各自花芽分化19 d時(shí)莖尖端基因表達(dá)情況的比較；K326花芽分化當(dāng)天，K326與華煙06的比較；花芽分化時(shí)K326莖尖端基因表達(dá)情況與華煙06的比較（表1）。其中K326與華煙06距離各自花芽分化相同時(shí)間的莖尖端未花芽分化時(shí)的差異探針數(shù)最多，有5295個(gè)；K326分化當(dāng)天各品種（品系）之間相比較差異探針數(shù)量最少，有2116個(gè)。

2.3縱向比較中差異基因的功能分類及富集分析

華煙06中與分子功能相關(guān)的差異表達(dá)基因可分為13類，而K326只有12類，其中少了蛋白標(biāo)簽（protein tag）；華煙06中與細(xì)胞組分相關(guān)的差異基因有9類，K326有10類，多了與共質(zhì)體（symplast）相關(guān)的基因（表2）。

K326花芽分化過程中，未分化與分化相比，分子功能中顯著富集的差異基因主要與催化性能、轉(zhuǎn)運(yùn)性能、結(jié)合性能和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)性能有關(guān)，這與華煙06一致；K326花芽分化與分化后5 d相比，除了與催化性能、轉(zhuǎn)運(yùn)性能、結(jié)合性能和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)性能有關(guān)的基因在莖尖端顯著富集之外，與酶調(diào)節(jié)活性、營養(yǎng)貯存活性有關(guān)的基因也顯著富集；與細(xì)胞組成相關(guān)的顯著富集的基因有胞外區(qū)、細(xì)胞、細(xì)胞器及細(xì)胞組分相關(guān)的基因等（圖2）。

K326和華煙06花芽分化過程中與生物學(xué)過程相關(guān)的基因分類共有24種，通過極顯著富集篩選出16種，其中包括發(fā)育過程、刺激應(yīng)答、生殖過程等（表3）。

表2　差異表達(dá)基因的GO功能分類Table2　GO functional category of differential expressed genes

表3　與生物學(xué)過程相關(guān)的極顯著富集基因Table3　Biological process related highly significantly enriched genes

2.4橫向比較中差異基因的功能分類與富集分析

K326和華煙06距離各自花芽分化天數(shù)相同、花芽未分化的莖尖端基因表達(dá)情況相比，與分子功能相關(guān)的顯著富集的基因主要與催化性能、轉(zhuǎn)運(yùn)性能、結(jié)合性能和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)性能相關(guān)，K326分化當(dāng)天與華煙06相比，與催化性能、轉(zhuǎn)運(yùn)性能、結(jié)合性能和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)性能相關(guān)的差異基因顯著富集，K326、華煙06花芽分化時(shí)的差異表達(dá)基因中，與催化性能、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、結(jié)合性能、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)性能、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性有關(guān)的基因顯著富集；K326和華煙06距離各自花芽分化相同天數(shù)的差異表達(dá)基因中，與細(xì)胞組成相關(guān)的顯著富集的基因主要與細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞組分、胞外區(qū)組分、胞外區(qū)相關(guān)，K326分化當(dāng)天，與胞外區(qū)、細(xì)胞、細(xì)胞組分相關(guān)的基因顯著富集（圖3）。

圖3　橫向比較中與分子功能及細(xì)胞組成相關(guān)的顯著富集基因Fig.3　Molecular function related and cellular component related significantly enriched genes by horizontal comparison

K326分化當(dāng)天差異表達(dá)基因最少，其中對(duì)死亡、刺激反應(yīng)、定位、生物調(diào)節(jié)及生物調(diào)節(jié)進(jìn)程相關(guān)、生物進(jìn)程正向調(diào)節(jié)相關(guān)的差異基因都有極顯著富集（圖4）。

3　 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，在低溫誘導(dǎo)下，K326移栽后65 d即開始現(xiàn)蕾，而華煙06則表現(xiàn)出了明顯的抗早花特性，移栽后60 d才開始花芽分化。植物對(duì)環(huán)境刺激高度敏感，Lee等［12］的研究結(jié)果表明，即便是短時(shí)期的觸碰和黑暗處理也會(huì)導(dǎo)致植物基因芯片檢測結(jié)果存在較大差異。從本試驗(yàn)的比較結(jié)果看，K326與華煙06花芽均未分化且距離各自花芽分化時(shí)間相同點(diǎn)相比的差異探針數(shù)最多，達(dá)到5295個(gè)，而K326分化當(dāng)天，二者之間相比差異探針數(shù)量最少，差異探針數(shù)為2116個(gè)，這說明基因表達(dá)差異不僅與植株的生長發(fā)育時(shí)期及遺傳因素有關(guān)，更多的表達(dá)可能與氣溫及日照長短有關(guān)。

圖4　橫向比較中與生物學(xué)過程相關(guān)的極顯著富集基因Fig.4　Biological process related highly significantly enriched genes by horizontal comparison

各品種（品系）生長發(fā)育過程中，分子功能、細(xì)胞組成、生物學(xué)過程相關(guān)的差異基因數(shù)量雖有一定差異，但分布比例是一致的，這說明K326與華煙06生長發(fā)育過程中基因總體的調(diào)控機(jī)制是相似的，這說明調(diào)控不同烤煙品種（品系）生長的基本機(jī)理相近，是否具有耐低溫抗早花特性取決于少量特殊基因的表達(dá)。

為了進(jìn)一步了解花芽分化過程中基因的表達(dá)變化及調(diào)控機(jī)制，有必要對(duì)差異基因進(jìn)行顯著和極顯著富集分析，以確定差異表達(dá)基因行使的主要生物功能及其對(duì)植株花芽形成所具有的影響［13］。雖然K326花芽分化當(dāng)天的差異基因數(shù)量最少，但通過顯著富集分析，與營養(yǎng)儲(chǔ)蓄相關(guān)的差異基因顯著富集，這可能與植株的生長發(fā)育狀態(tài)有密切關(guān)系。從與細(xì)胞組成相關(guān)的差異基因的顯著富集分析看，K326花芽分化與分化后5 d相比的差異基因的分類要多于其未分化與分化時(shí)相比的差異基因分類；而華煙06花芽未分化1與花芽未分化2相比，與細(xì)胞組成相關(guān)的差異基因種類要比未分化2與分化時(shí)相比的多，調(diào)控細(xì)胞生長的基因的表達(dá)有待進(jìn)一步研究。

4　結(jié)論

本試驗(yàn)通過比較分析，初步了解了K326及其抗早花品系花芽分化過程中基因的調(diào)控及表達(dá)機(jī)制。與分子功能相關(guān)的差異基因主要與催化性能、轉(zhuǎn)運(yùn)性能、結(jié)合性能和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)性能有關(guān)；與細(xì)胞組成相關(guān)顯著富集的差異基因主要是與細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞器相關(guān)的基因；與生物學(xué)過程相關(guān)的差異基因種類最多最復(fù)雜，涉及到植株抗逆性、生長、發(fā)育等方面，這可為進(jìn)一步研究并從中搜尋與煙草開花相關(guān)的基因提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］SteinbergRA. Premature blossoming ：effects of vernalization，seedling age and environment on subsequent growth and flowering of transplanted tobacco［J］. Plant Physiology ，1952，27（4）：745-753.

［2］ 張國，朱列書，王奎武，等. 煙草早花研究進(jìn)展［J］. 作物研究，2005（5）：383-385.

［3］ 種康，雍偉東，譚克輝. 高等植物春化作用研究進(jìn)展［J］.植物學(xué)通報(bào)，1999，16（5）：481-487.

［4］ Yanofsky M F， Ma H， Bowman J L， et al. The protein encoded by the Arabidopsis homeotic gene agamous resembles transcription factors. Nature， 1990， 346：35-39.

［5］ HorvathDP. Common mechanisms regulate flowering and dormancy［J］. Plant Science，2009，177（6） ：523-531.

［6］ Matsuda N， Ikeda K， Kurosaka M， et al. Early flowering phenotype in transgenic pears （Pyrus communis L.）expressing the CiFT gene［J］.Japan.Soc.Hort.Sci，2009，78 （4）： 410-416.

［7］ 許志茹，李玉花. 基因芯片技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用［J］.生物技術(shù)，2004，14（6）：70-72.

［8］ 朱素琴，季本華，陳名蔚. 高鹽低溫脅迫下水稻轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)譜分析［J］. 科技通報(bào)，2010，26（6）：844-852.

［9］ 宋雯雯，李文濱，韓雪. 干旱脅迫下大豆幼苗根系基因的表達(dá)譜分析［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（22）：4579-4586.

［10］ 許州達(dá)，景瑞蓮，甘強(qiáng)，等. 用水稻基因芯片篩選小麥耐旱相關(guān)基因［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，15（5）：821-827.

［11］ 曾黎瓊，張偉，段玉云，等. 利用基因芯片分析非洲菊花序發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)［J］. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，22（3）：759-763.

［12］ Lee D， Polisensky D H，Braam J.Genome-wide identification of touch and darkness-regulated arabidopsisgenes：a focus on calmodulin-like andXTHgenes［J］. New Phytologist，2005，165（2）：429-444.

［13］ 劉明，王米渠，丁維俊，等. 表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)的基因功能富集分析［J］. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2010，27（5）：1166-1168，1196.

中圖分類號(hào)：S572.03

文章編號(hào)：1007-5119（2015）02-0093-06

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2015.02.017

基金項(xiàng)目：國家煙草專賣局重點(diǎn)科技項(xiàng)目“耐低溫抗早花烤煙新品種選育及遺傳生理機(jī)理研究”（110200902043）；廣東省煙草專賣局（公司）科技項(xiàng)目“耐低溫抗早花烤煙新品種選育”（200816）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“抗早花煙草成花生理信號(hào)物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)及其抵御低溫的生理機(jī)理研究”（31101108）

作者簡介：楊靜，女，碩士研究生，研究方向?yàn)闊煵葸z傳育種。E-mail：yangjinggzchina@163.com。*通信作者，E-mail：wangwei@scau.edu.cn

收稿日期：2014-07-08 修回日期：2015-03-09

Gene Expression Profile Analysis of Flue-cured Tobacco K326and thePremature Flowering Resistance Varieties

YANG Jing1，2， CHEN Jie3， CHEN Jianjun2， DENG Shiyuan2， QIU Miaowen4， ZHAO Weicai4， WANG Wei2*
（1.Zhenyuan County Tobacco Company of Guizhou Province， Zhenyuan， Guizhou 557700， China； 2.College of Agriculture， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China；3. Qiandongnan Tobacco Company of Guizhou Province， Kaili，Guizhou 556000， China；4.Nanxiong Institute of Tobacco Science， Guangdong Provincial Tobacco Company， Nanxiong， Guangdong 512400，China）

Abstract：To study the regulation and formation mechanismof premature flowering and premature flowering resistance of flue-cured tobacco， we used the Agilent Tobacco Oligo Microarray to deduce the expression profiling of flue-cured tobacco K326 and its premature flowering resistance variety Huayan06 under the flower bud differentiation process. The result showed that the same days from their flower bud differentiation the number of differential probes were the maximum amount of the comparative item between K326 and Huayan06. The number of the probe was 5295. On the day of K326 flower bud differentiation， the number of differential probe was the minimum amount. The number of the probe was 2116. The molecular function mainly included catalytic activity，transporter activity， binding and transcription regulator activity. The cellular component mainly included cell， cell part and organelle. The biological process was the most complex， involved plant resistance， growth， development， etc. It would establish a basis for the further study and search for genes associated with tobacco flowering.

Keywords:flue-cured tobacco； premature flowering； premature flowering resistance； gene chip； expression profile