閆　寧，龔達(dá)平，張忠鋒

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

煙草甾醇合成代謝分子調(diào)控研究進(jìn)展

閆寧，龔達(dá)平，張忠鋒*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

摘要：煙葉中的甾醇在卷煙燃燒過程中生成致癌物-多環(huán)芳烴（PAHs）。筆者主要闡述了植物甾醇在卷煙減害研究、調(diào)控植物生長發(fā)育和響應(yīng)植物脅迫中的作用，重點(diǎn)介紹了植物甾醇合成代謝途徑以及該途徑中的關(guān)鍵酶基因。

關(guān)鍵詞：甾醇生物合成；多環(huán)芳烴；生長發(fā)育；逆境脅迫；關(guān)鍵酶

甾醇（sterol）屬于大分子醇類，是自然界中廣泛存在的一類甾族化合物。自然界中的甾醇根據(jù)其來源分為動物甾醇、菌甾醇和植物甾醇。其中，動物甾醇中最常見的為膽固醇（cholesterol），已有研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇在植物的種子以及根、莖、葉、花中也普遍存在［1］。菌甾醇中最常見的為麥角甾醇（ergosterol），它主要存在于霉菌和蘑菇中［2］。植物甾醇是生物膜系統(tǒng)的重要組成成分，常見的植物甾醇有豆甾醇（stigmasterol）、谷甾醇（sitosterol）、菜油甾醇（campesterol）、燕麥甾醇（avenasterol）和菠菜甾醇（spinasterol）等［3］。植物甾醇是一類重要的生理活性物質(zhì)，除了調(diào)控植物生長發(fā)育外，還響應(yīng)多種生物和非生物脅迫［4］。

甾醇是煙草中一類重要的化合物，甾醇類物質(zhì)約占煙葉質(zhì)量的0.1%～0.3%，由于甾醇的結(jié)構(gòu)中都含有羥基，熱解時其母體的四輪環(huán)戊烯［α］菲環(huán)結(jié)構(gòu)可形成致癌物-多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons， PAHs），因此煙草中的甾醇是一種潛在的影響人體健康的物質(zhì)［5-7］。降低煙草成熟葉片中甾醇含量有望成為降低卷煙危害的有效途徑。本綜述的目的在于總結(jié)煙草甾醇合成代謝途徑以及該途徑中的關(guān)鍵酶基因，提出通過基因工程手段降低甾醇合成代謝基因表達(dá)進(jìn)而降低煙葉中甾醇含量的方法和思路，為低甾醇煙草育種提供借鑒。

1　煙草中植物甾醇的存在、類型以及對卷煙安全性的影響

煙草中的植物甾醇主要有豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇和膽固醇［8］，霉變的煙葉中還含有麥角甾醇［9］。

在煙草中，豆甾醇、β-谷甾醇含量較高，菜油甾醇含量次之，膽固醇含量最低［10］。甾醇類在煙草中以游離態(tài)（FS）和結(jié)合態(tài)存在，結(jié)合態(tài)包括與脂肪酸形成甾醇酯（SE），以及與糖類形成的甾醇糖苷（SG）和?；薮继擒眨ˋSG）［11］。

煙草中植物甾醇主要存在于細(xì)胞膜中，不但能促進(jìn)煙草生長，而且對煙草的安全性和品質(zhì)有較大的影響。卷煙煙氣是一種極其復(fù)雜的混合物，它是在卷煙抽吸過程中由煙草燃燒、裂解和蒸餾而產(chǎn)生的［12］。在煙草和煙氣中鑒定出的5000多種化合物中，有害和致癌成分僅100多種，以苯并［α］芘、苯并［α］蒽和Chrysene為代表的多環(huán)芳烴屬于完全致癌的化合物［13］。和食品和其他植物中的甾醇不同，煙草甾醇在卷煙抽吸時約有20%～25%完整的轉(zhuǎn)移到主流和側(cè)流煙氣中，甾醇中的羥基在高溫?zé)峤鈺r會與其母體的四輪環(huán)戊烯［α］菲環(huán)結(jié)構(gòu)形成多環(huán)芳烴［5-6］。劉少民等［14］研究表明，游離甾醇的總量與主流煙氣中PAHs的釋放量和苯并［a］芘的釋放量都呈顯著正相關(guān)，其中豆甾醇、麥角甾醇對苯并［α］芘的貢獻(xiàn)較大。Schmeltz等［15］將煙草植株放在放射性的14CO2環(huán)境下生長，從成熟煙葉中提取出包括甾醇類化合物在內(nèi)的多種含有放射性標(biāo)記碳的組分添加到卷煙中，通過放射性產(chǎn)物的質(zhì)譜鑒定在卷煙煙氣中檢測到14C標(biāo)記的苯并［α］芘。Stedman［16］研究表明，豆甾醇在750℃下熱解生成苯并［α］芘；Badger等［17］研究表明，在豆甾醇的裂解過程中，甾醇骨架經(jīng)過一系列單分子反應(yīng)后形成了菲、蒽等多環(huán)芳烴。

2　植物甾醇在調(diào)控植物生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫中的作用

植物甾醇是一類重要的生理活性物質(zhì)，不僅在調(diào)控植物的生長發(fā)育中具有重要作用，而且對響應(yīng)植物逆境脅迫也具有重要功能。植物甾醇是生物膜系統(tǒng)的重要組分，與膜的穩(wěn)定性密切相關(guān)；植物主要通過調(diào)控甾醇含量變化維持膜的穩(wěn)定性及影響脂質(zhì)筏的生物功能響應(yīng)逆境脅迫［4］。下面分別介紹植物甾醇在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和響應(yīng)生物脅迫、非生物脅迫中的作用。

2.1 植物甾醇在調(diào)控植物生長發(fā)育中的作用

植物甾醇主要存在于細(xì)胞膜上，在細(xì)胞膜中的存在形式有游離型和結(jié)合型（與脂肪酸或糖結(jié)合），它可以影響膜的流動性和滲透性［18］。對擬南芥甾醇生物合成缺失突變體的研究表明，植物甾醇在細(xì)胞伸長、纖維素合成和細(xì)胞壁形成過程中具有重要作用，而且細(xì)胞膜中適宜的甾醇組成對酶活性、離子和代謝物的運(yùn)輸、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)與脂類物質(zhì)的相互作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和膜的流動性等方面有非常重要的影響［19-21］。植物甾醇還可以改變植物激素對細(xì)胞骨架調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而影響許多細(xì)胞發(fā)育的相關(guān)過程［22］。植物甾醇具有促進(jìn)細(xì)胞伸長的生理功能，表現(xiàn)在其缺失突變體和不敏感突變體都表現(xiàn)為植株矮化、葉柄縮短等，其主要原因是細(xì)胞伸長受到抑制［20］。Schrick等［21］研究發(fā)現(xiàn)，植物甾醇合成被擾亂后纖維素含量明顯下降，而且一些甾醇抑制劑（例如，15-azasterol和fenpropimorph）也能導(dǎo)致纖維素含量顯著降低。Peng等［23］研究發(fā)現(xiàn)，谷甾醇是纖維素合成的引物，UDP-葡萄糖首先與谷甾醇結(jié)合形成谷甾醇-β-葡萄糖苷才開始纖維素的延伸，這一研究結(jié)果為谷甾醇在纖維素合成中的作用提供了直接的證據(jù)。

2.2 植物甾醇響應(yīng)生物脅迫

植物甾醇可以通過防御反應(yīng)識別病原菌，然而疫霉屬病原菌不能合成甾醇，只能依賴從宿主植物中獲得甾醇［24］。Kopischke等［25］研究發(fā)現(xiàn)，疫霉屬病原菌侵染擬南芥磷脂：甾醇?；D(zhuǎn)移酶（erp1）突變體后，相對于野生型植株，其自由甾醇含量無明顯變化，SG含量升高2倍，ASG含量顯著降低，突變體植株的疫霉屬病原菌抗性降低。這說明結(jié)合甾醇含量的變化對病原菌的防衛(wèi)反應(yīng)有重要作用，植物可通過減少對寄生性疫霉屬甾醇的供應(yīng)增強(qiáng)植物對疫霉屬病原菌的抗性。白粉病菌侵染擬南芥和大麥后，細(xì)胞膜脂質(zhì)筏區(qū)域的甾醇大量積累［26］。細(xì)菌性病原菌侵染擬南芥后，葉片豆甾醇含量增加，豆甾醇又能夠激活質(zhì)膜上H+-ATPase，改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，以響應(yīng)免疫反應(yīng)［27-28］。Griebel和Zeier等［27］研究發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)菌性角斑病激活甾醇去飽和酶基因的表達(dá)，豆甾醇含量增加，并且抑制病原菌誘導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)調(diào)控子黃素依賴型單加氧酶的表達(dá)?？傊?，植物通過調(diào)控植物甾醇合成酶的表達(dá)控制甾醇含量的變化，從而引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的改變以響應(yīng)病原菌的侵染。

2.3 植物甾醇響應(yīng)非生物脅迫

植物甾醇在響應(yīng)鹽脅迫、溫度脅迫等非生物脅迫中有重要的作用。在鹽脅迫下，擬南芥中的菜油甾醇與豆甾醇的含量分別降低13%和6%，而谷甾醇含量增加5%，谷甾醇/豆甾醇比值由2.149上升至2.372，谷甾醇/豆甾醇的比值的提高有利于鹽脅迫下細(xì)胞膜功能的調(diào)節(jié)，增強(qiáng)耐鹽性［29］。Grandmougin等［30］證明在鹽脅迫下特定的植物甾醇可以調(diào)控細(xì)胞膜結(jié)合的H+-ATPase的活性，低濃度的豆甾醇和膽固醇可以刺激質(zhì)子的外排，而24-甲基膽固醇和谷甾醇則起抑制作用。Erick和Dufourc［31］研究發(fā)現(xiàn)在高溫和低溫脅迫下植物中的甲基甾醇大量轉(zhuǎn)化成乙基甾醇（谷甾醇和豆甾醇），這種甾醇組成的變化有利于增強(qiáng)細(xì)胞膜的內(nèi)聚力，調(diào)節(jié)植物體的溫度變化，以適應(yīng)高溫和低溫環(huán)境。Manish［32］研究表明，低溫環(huán)境促進(jìn)了植物甾醇的積累，同時發(fā)現(xiàn)高溫和低溫環(huán)境下植物甾醇濃度與土壤pH和碳水化合物含量變化是一致的，但與植物蛋白和苯酚含量變化是相反的。植物甾醇在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，然后從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜，這種轉(zhuǎn)運(yùn)在低溫環(huán)境下被阻斷［33］。另外，植物甾醇還響應(yīng)光照、干旱、ABA等非生物脅迫。Mariana等［34］研究發(fā)現(xiàn)低劑量UV-B照射葡萄時，豆甾醇、谷甾醇含量增加，且谷甾醇/豆甾醇比值增加了7倍。在干旱脅迫下，植物甾醇以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動性和通透性抑制水分流失［35］。植物甾醇能抑制由ABA所引起的膜透性的提高，從而最終維持細(xì)胞膜的正常功能［36］。因此，在鹽脅迫、溫度脅迫、光照脅迫、干旱脅迫和ABA等非生物脅迫下，植物中甾醇的組成及其在細(xì)胞的不同結(jié)構(gòu)中轉(zhuǎn)運(yùn)的變化有助于維持細(xì)胞膜的正常生理功能，以響應(yīng)非生物脅迫。

3　 植物甾醇的合成代謝途徑

植物甾醇合成的第一個階段是由3個乙酰-CoA分子經(jīng)過6C的3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA（HMG-CoA）和6C的甲羥戊酸（MVA）形成5C的異戊烯基焦磷酸（IPP）分子。乙酰-CoA在HMG-CoA合成酶的作用下形成HMG-CoA，HMG-CoA在HMG-CoA還原酶的作用下形成MVA，MVA在甲羥戊酸激酶的作用下形成5-磷酸甲羥戊酸，5-磷酸甲羥戊酸在磷酸甲羥戊酸激酶的作用下形成5-焦磷酸甲羥戊酸，5-焦磷酸甲羥戊酸在5-焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶的作用下形成IPP（圖1）。甾醇合成的第二個階段是IPP分子聚合，經(jīng)過C10的牦牛兒基焦磷酸（GPP）和C15的法尼基焦磷酸（FPP）形成的C30的鯊烯（squelene）。IPP在異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶的作用下形成二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP），DMAPP在異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的作用下形成GPP，GPP在法呢基焦磷酸合酶的作用下形成FPP，F(xiàn)PP在鯊烯合酶的作用下形成鯊烯（圖1）。應(yīng)該指出的是，對植物、真菌和動物細(xì)胞來說，甾醇生物合成途徑中從乙酰-CoA到鯊烯階段是相同的。然后，在動物和真菌中，鯊烯分子環(huán)化形成30C的羊毛甾醇（lanosterol）；而在植物體內(nèi)則形成環(huán)阿屯醇（lanosterol）的C30前體。最后，動物和真菌30C的羊毛甾醇形成27C的膽甾醇；植物體內(nèi)的環(huán)阿屯醇在一系列酶的作用下形成豆甾醇、谷甾醇和菜油甾醇等（圖1）［37］。植物甾醇和動物甾醇（膽固醇）的區(qū)別是C-24位置多了額外的烷基，這個過程由甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶（SMTs）完成［4］。SMTs

Nicotiana langadorffii雜交種的FPS基因的核酸序列同源性分別為74%、76%、77%、80%和97%。FPP不僅是植物甾醇的合成前體，同時還可在煙草倍半萜環(huán)化酶：馬兜鈴烯合成酶的作用下生成包括植保素在內(nèi)的倍半萜衍生物［47］，因此通過基因工程手段調(diào)控?zé)煵葭薮己铣纱x可能會影響煙草倍半萜類植保素的含量。崔紅等［48］研究發(fā)現(xiàn)，薄荷FPS基因轉(zhuǎn)入煙草后，煙株對赤星病的抗性增強(qiáng)。李雪君等［49］將薄荷FPS基因轉(zhuǎn)入煙草中，烤后煙葉中8種類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、茄酮、新植二烯含量比對照都有不同程度的提高，綜合評吸較好。

4.3 鯊烯合酶

鯊烯合酶（squalene synthase），簡稱SQS，它催化兩分子的FPP合成鯊烯（圖1）。鯊烯合酶在甾醇的生物合成中起著關(guān)鍵的作用，這在酵母菌甾醇合成代謝中已被證實(shí)［50］。Threlfall等［51］研究表明，利用真菌誘導(dǎo)子處理煙草的愈傷組織會降低愈傷組織中鯊烯合酶活性和植物甾醇含量。Devarenne等［52］研究表明，鯊烯合酶的調(diào)控可能發(fā)生在從轉(zhuǎn)錄到翻譯后加工的多個水平上。Wentzinger等［53］發(fā)現(xiàn)，用鯊烯合酶和鯊烯環(huán)氧酶的特異性抑制劑squalestatin-1和terbinafine處理煙草細(xì)胞的懸浮系，都能夠提高細(xì)胞中HMGR的酶活性。Kim等［54］研究發(fā)現(xiàn)煙草、擬南芥和人參SQS基因具有3個高度保守區(qū)域，被認(rèn)為是與SQS酶活性相關(guān)的區(qū)域。Manavalan等［55］發(fā)現(xiàn)，RNAi抑制水稻SQS基因后，在缺水條件下，植株生物量和籽粒產(chǎn)量提高，葉片氣孔導(dǎo)度降低，抗旱性提高。最近，陳千思等［56］克隆到煙草SQS基因，并將構(gòu)建好的病毒介導(dǎo)的基因沉默載體接種本氏煙草，發(fā)現(xiàn)該基因沉默植株中甾醇含量下降了41.26%，這說明沉默SQS基因可以顯著降低煙草甾醇含量。

4.4 鯊烯環(huán)氧酶

鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase），簡稱SQE，是一種細(xì)胞膜結(jié)合酶，催化鯊烯合成鯊烯2，3-氧化物（圖1），是甾醇生物合成途徑中的限速酶之一。在酵母菌中，鯊烯環(huán)氧酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂質(zhì)粒中均有表達(dá)［57］。Hideyuki等［58］從蒺藜狀苜蓿中分離出SQE1和SQE2，它們均可補(bǔ)充了酵母菌突變菌株KLN1中麥角甾醇的生物合成，這表明SQE1和SQE2都參與了蒺藜狀苜蓿中甾醇的生物形成。在人參三萜皂苷生物合成研究中，Choi等［59］發(fā)現(xiàn)了3個編碼SQE的轉(zhuǎn)錄物，這表明在人參基因組中SQE構(gòu)成了一個小的多基因家族。Han等［60］研究發(fā)現(xiàn)，抑制SQE1基因后人參根系中的三萜皂苷含量降低，但SQE2和環(huán)阿屯醇合酶基因表達(dá)量卻提高，進(jìn)而導(dǎo)致植物甾醇含量提高。最近，陳千思等［61］克隆到煙草SQE基因，研究發(fā)現(xiàn)SQE在煙草幼嫩組織中特異性的高表達(dá)，將構(gòu)建好的病毒介導(dǎo)的基因沉默載體接種本氏煙草，發(fā)現(xiàn)該基因沉默植株中甾醇含量下降了21.37%。

4.5 環(huán)阿屯醇合酶

環(huán)阿屯醇合酶（cycloartenol synthase），簡稱CAS，它催化鯊烯2，3-氧化物形成環(huán)阿屯醇（圖1）。環(huán)阿屯醇是植物甾醇生物合成的前體物，因此CAS是甾醇生物合成的一個關(guān)鍵基因。目前，多種植物的CAS cDNA序列已經(jīng)被克隆，其中包括擬南芥［62］、西葫蘆［63］和水稻［64］等。CAS基因缺失后，擬南芥β-谷甾醇含量降低，鯊烯2，3-氧化物含量升高［65］；抑制人參CAS基因后，植物甾醇含量降低約50%，三萜皂苷含量提高50%～100%［66］。鯊烯2，3-氧化物形成甾醇存在2種途徑：植物中主要是通過CAS催化形成環(huán)阿屯醇進(jìn)行，酵母菌和動物中是通過羊毛甾醇合酶（LAS）催化形成羊毛甾醇進(jìn)行［37］。因此，在LAS基因缺失的酵母菌中，可以利用酵母異源互補(bǔ)法對煙草CAS基因進(jìn)行功能驗(yàn)證［62］。

5　展望

煙草甾醇是卷煙煙氣中多環(huán)芳烴的主要前體物，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)或瞬時表達(dá)技術(shù)干擾、沉默或敲除煙草甾醇合成代謝關(guān)鍵基因，可以獲得甾醇含量降低的煙草轉(zhuǎn)化植株［56，61］。筆者通過歸納總結(jié)植物甾醇合成代謝途徑及該途徑中的關(guān)鍵酶基因，為利用基因工程手段降低卷煙危害探索可行性的方法和思路。同時，植物甾醇是一類重要的生理活性物質(zhì)，不僅對調(diào)控植物生長發(fā)育具有重要作用，而且在響應(yīng)植物生物脅迫和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。因此，通過基因工程手段調(diào)控植物甾醇合成代謝關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，有望在提高煙草應(yīng)對逆境脅迫能力方面發(fā)揮作用。

綜上可見，將來的研究可以從完善煙草甾醇合成代謝途徑入手，開展煙草甾醇合成代謝關(guān)鍵酶基因的克隆、表達(dá)分析和調(diào)控機(jī)制等的研究。通過對煙草甾醇合成代謝相關(guān)酶的性質(zhì)以及相關(guān)基因異源表達(dá)的酶活性和反應(yīng)動力學(xué)分析，確定煙草甾醇合成代謝的關(guān)鍵酶基因。同時，利用基因工程原理與技術(shù)構(gòu)建、篩選甾醇敏感株突變體，研究相關(guān)酶基因在煙草甾醇合成代謝途徑中的作用。另外，植物甾醇響應(yīng)逆境脅迫的生理機(jī)制比較復(fù)雜，以后應(yīng)該重點(diǎn)研究植物甾醇合成酶的表達(dá)調(diào)控與植物甾醇含量變化的相關(guān)性，探索植物甾醇合成關(guān)鍵酶基因在植物響應(yīng)逆境脅迫中的作用。

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中圖分類號：TS413

文章編號：1007-5119（2015）02-00110-08

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2015.02.020

基金項(xiàng)目：中國煙草總公司科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目“煙草低苯并芘突變體的篩選和基因定位研究”（110201401008CJT-08）

作者簡介：閆寧，男，博士，助理研究員，主要從事煙草功能成分與綜合利用研究。E-mail：yanning5110@163.com

*通信作者，E-mail：zhangzhongfeng@caas.cn

收稿日期：2014-05-14修回日期：2014-06-30

Advances in the Molecular Regulation of Tobacco Sterol Biosynthesis Metabolism

YAN Ning， GONG Daping， ZHANG Zhongfeng*
（Tobacco Research Institute of ChineseAcademy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China）

Abstract:Plant sterols in tobacco leaves can generate the carcinogen - polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） in the combustion process of cigarette. In this article， the roles of plant sterols in tobacco harm reduction research， the regulation of plant growth and development， and the response to plant stress were primarily discussed， and the plant sterol biosynthetic pathway and key enzymes in this pathway were mainly introduced.

Keywords:sterol biosynthesis； polycyclic aromatic hydrocarbon； growth and development； stress； key enzyme