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代謝組學(xué)在輻射損傷研究中的應(yīng)用

郭明星，吳誠，童衛(wèi)杭

[作者單位] 100088 北京，第二炮兵總醫(yī)院藥學(xué)部

[關(guān)鍵詞]輻射損傷; 代謝組學(xué); 機(jī)制研究; 生物標(biāo)志物

隨著核能及放射技術(shù)在各領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，人們的工作和日常生活不可避免的會接觸輻射，輻射造成的損傷也日益受到關(guān)注。輻射流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長期低劑量輻射會出現(xiàn)頭暈、乏力、記憶力減退等癥狀[1-5]，大劑量輻射會造成造血、胃腸、神經(jīng)血管和皮膚等一個或多個系統(tǒng)損傷，引起神經(jīng)、內(nèi)分泌等系統(tǒng)調(diào)節(jié)障礙，破壞機(jī)體組織的蛋白質(zhì)、核酸和酶等引起機(jī)體物質(zhì)代謝紊亂[6-7]。輻射損傷是多層次、多步驟、多階段的復(fù)雜過程[8]，目前迫切需要對其損傷機(jī)制和早期診斷進(jìn)行研究。

代謝組學(xué)是指通過考察生物體系(細(xì)胞、組織或生物體)受刺激或擾動后(如將某個特定的基因變異或環(huán)境變化后)，其代謝產(chǎn)物(內(nèi)源性代謝物質(zhì))種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的學(xué)科[9]。目前輻射損傷在基因水平和細(xì)胞水平已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究，但由于其損傷的復(fù)雜性和終端表象的差異性，對輻射損傷的研究仍沒有突破性進(jìn)展?；谳椛鋼p傷最終都會導(dǎo)致終端代謝物的一系列變化，通過代謝組學(xué)技術(shù)在整體代謝水平上研究輻射損傷的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，有助于我們發(fā)現(xiàn)可用于輻射損傷早期診斷、療效評估和預(yù)后的標(biāo)志物。本文就近年代謝組學(xué)在輻射損傷中的研究做一綜述。

1代謝組學(xué)研究方法

代謝組學(xué)研究流程主要包括樣品采集與前處理、數(shù)據(jù)的采集和數(shù)據(jù)分析3個步驟。1.1代謝組學(xué)樣品采集與前處理代謝組學(xué)的研究對象廣泛，目前對體液(血液、尿液、腦脊液等)，組織，細(xì)胞培養(yǎng)液等的樣品采集和前處理均發(fā)表了相關(guān)操作規(guī)程[10-14]。其中應(yīng)用于輻射損傷的研究樣本多為尿液和血液(血清和血漿)。研究學(xué)者通常根據(jù)檢測代謝物個數(shù)的不同將代謝組學(xué)分為靶標(biāo)代謝組學(xué)和非靶標(biāo)代謝組學(xué)[15]。靶標(biāo)代謝組學(xué)是指一定數(shù)量的代謝物的定性、定量分析;非靶標(biāo)代謝組學(xué)是指無偏見的測量和比較盡可能多的代謝物。目前對于輻射代謝組學(xué)的研究大部分局限于非靶標(biāo)代謝組學(xué)機(jī)制探索階段，進(jìn)一步的靶標(biāo)代謝組學(xué)生物標(biāo)志物驗證研究仍存在不足。

1.2代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集技術(shù)目前，代謝組學(xué)研究主要的數(shù)據(jù)采集技術(shù)為基于核磁共振光譜(NMR)和質(zhì)譜(MS)的檢測技術(shù)。其中應(yīng)用最廣的為NMR、液相色譜質(zhì)譜連用(LC-MS)和氣相色譜和質(zhì)譜連用(GC-MS)技術(shù)，各類檢測技術(shù)均有其優(yōu)缺點(diǎn)。代謝組學(xué)是基于NMR技術(shù)發(fā)展起來的一門學(xué)科，NMR對生物樣品的選擇寬泛，不需要復(fù)雜的樣品前處理，對樣品無破壞性，檢測無偏向性，但對酸堿度、離子濃度、溫度都很敏感，分析靈敏度低、譜圖重疊相互干擾，導(dǎo)致圖譜解析困難。GC-MS是分析揮發(fā)性化合物的一種高效技術(shù)，適用于GC-MS分析的化合物必須是可揮發(fā)的或是經(jīng)過衍生化可揮發(fā)的化合物。GC-MS分析速度快，靈敏度高的特點(diǎn)有利于微量物質(zhì)的分析，較高的柱效加上合適的梯度升溫可以將絕大多數(shù)的峰形加以分離以用于定量;以較完整的譜庫為基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)分析軟件為未知物質(zhì)的定性提供了極大的便利。GC-MS技術(shù)最大的缺陷是往往需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理，對生物樣品中的原始信息造成了干擾，不利于代謝組學(xué)的“全譜”分析。LC-MS相對于GC-MS可以分析較高極性和較大分子量的化合物，并且樣品無需衍生化處理。隨著超高效液相色譜(UPLC)和高分辨質(zhì)譜(Q-TOF/MS和LTQ/Orbitrap等)的出現(xiàn)，為復(fù)雜生物樣品提供了更好的分離能力和結(jié)構(gòu)鑒定能力。目前，有些研究常采用多種技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合檢測，進(jìn)行分析方法的整合，來提高檢測數(shù)據(jù)的全面性。

1.3代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析技術(shù)代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)分析一般包括:數(shù)據(jù)預(yù)處理、模式識別、代謝物鑒定和生物標(biāo)志物驗證。數(shù)據(jù)預(yù)處理主要包括濾噪、峰識別、重疊峰解析、峰對齊、峰補(bǔ)齊和歸一化等。經(jīng)過數(shù)據(jù)預(yù)處理后，得到的二維數(shù)據(jù)矩陣用于模式識別。模式識別包括無監(jiān)督學(xué)習(xí)方法和有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法。無監(jiān)督學(xué)習(xí)方法是將所得分類信息和樣品的原始信息比較，找出差別，其不需要任何有關(guān)樣本類別的知識，直接從己有數(shù)據(jù)中獲得樣本的類別歸屬。主要包括:主成分分析，層次聚類分析，自組織圖、聚類分析。有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法是利用多參數(shù)模型對樣品進(jìn)行識別和分類，其需要事先獲得樣本的分類信息，利用已知類別的樣本作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)建立和優(yōu)化有關(guān)分類模型，以對后續(xù)新樣本的類別進(jìn)行預(yù)測。主要包括:判別分析、偏最小二乘法、偏最小二乘- 判別分析、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等。

2代謝組學(xué)在輻射損傷研究中的應(yīng)用

輻射是由不同能量的電磁波尤其是χ、γ射線等高能電磁波，α、β粒子、超熱中子等放射性粒子以及鈾、氡、钚等放射性同位素引起的一種能量傳遞方式[16]。通常根據(jù)輻射頻率及作用形式分為電離輻射和非電離輻射。電離輻射是指能引起被作用物質(zhì)電離的輻射。對于生物組織來說，電離輻射的危害性很大，由于造成危害的主要是量子能量，而不是總能量，因此，即使在低功率照射下，也會產(chǎn)生累積效應(yīng)，造成生物組織的破壞與損傷。非電離輻射一般不引起物質(zhì)分子的電離，只導(dǎo)致分子的振動、轉(zhuǎn)動或電子能激狀態(tài)的改變，因此非電離輻射的量子能量不足以破壞分子，它對生物體的破壞與損傷，取決于其總能量，即必須在高功率和一定的照射時間下才能發(fā)生。非電離輻射會使生物體在沒有明顯升溫的條件下，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等功能紊亂。目前代謝組學(xué)在輻射損傷的研究大都集中于電離輻射損傷，對非電離輻射損傷研究較少。

2.1代謝組學(xué)在電離輻射研究中的應(yīng)用γ射線輻射生物體后，生物機(jī)體產(chǎn)生自由基，當(dāng)自由基產(chǎn)生過多而不能及時清除時就會引起一系列的輻射損傷[17-20]。四氫生物蝶呤(BH4)是一氧化氮合酶(NOS)的重要輔助因子。其缺乏將導(dǎo)致NOS解耦聯(lián)，生成自由基O2-，O2-能與NO反應(yīng)，生成ONOO-，ONOO-是一種很活潑的陰離子，可以破壞酶的結(jié)構(gòu)和功能，引起細(xì)胞損傷。有研究者采用代謝組學(xué)技術(shù)研究了非致死劑量的電離輻射在過表達(dá)GTPH-1 反饋調(diào)節(jié)蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中的代謝情況[21-22]，發(fā)現(xiàn)BH4的相對含量在輻射組明顯較低，并發(fā)現(xiàn)了一系列與氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化有關(guān)的代謝物。Ahmad等[23]采用1HNMR對γ射線輻射的小鼠尿液和血清進(jìn)行代謝組學(xué)分析，在5Gy照射后的小鼠尿液中，檸檬酸鹽、α-酮戊二酸、丁二酸、馬尿酸、三甲胺與非照射組相比具有明顯差異，通過相關(guān)的代謝路徑分析發(fā)現(xiàn)γ射線輻射擾亂了腸道微生物菌群的生長和機(jī)體能量代謝，血清研究還發(fā)現(xiàn)γ射線輻射損傷與脂質(zhì)代謝、能量代謝紊亂有關(guān)。

機(jī)體受到輻射作用后，血細(xì)胞的增殖、分裂功能下降，血細(xì)胞來源減少，白細(xì)胞下降，骨髓造血功能障礙[24]?；诖耍捎忙蒙渚€全身大劑量照射可建立血虛證模型。霍超等[25]采用60Coγ射線3．5Gy照射劑量全身1次性照射小鼠建立小鼠血虛證模型，并以四物湯連續(xù)7d灌胃給藥進(jìn)行干預(yù)。采用NMR技術(shù)檢測血清、胸腺、脾臟以及股骨上段骨髓組織提取液觀察其代謝譜的變化。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖、肌酐、磷酸化膽堿、膽堿、肌酸、乳酸、低密度脂蛋白等在正常組與輻射損傷所致血虛證組代謝波動較大，給予四物湯干預(yù)后相關(guān)化合物具有轉(zhuǎn)歸趨勢。輻射損傷所致血虛證的機(jī)制可能與機(jī)體無氧氧化功能受損、能量代謝和脂類代謝失調(diào)、細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡受到破壞以及機(jī)體免疫功能失調(diào)有關(guān)。IdleJR課題組對γ射線輻射生物標(biāo)志物進(jìn)行了一系列系統(tǒng)研究。該課題組首先采用兩個強(qiáng)度的γ射線(3Gy和8Gy)照射小鼠，收集小鼠照射前和照射后24h的尿液進(jìn)行UPLC-Q-TOF/MS代謝組學(xué)分析。研究發(fā)現(xiàn)尿液中胸苷的相對含量在γ射線照射組明顯高于非照射組[26]。隨后，該課題組又進(jìn)一步研究了γ射線低劑量照射(1Gy，2Gy，3Gy)小鼠尿液代謝輪廓隨強(qiáng)度的變化。研究發(fā)現(xiàn)，包括胸苷和2＇-脫氧尿苷在內(nèi)的脫氨嘌呤類和嘧啶類具有照射劑量和照射時間相關(guān)性[27]?？紤]到尿液中一些高極性化合物在UPLC系統(tǒng)中不保留不易分離，該課題組又采用GC-MS方法對γ射線照射的大鼠尿液代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)尿液中乙醛酸、胸腺嘧啶、尿嘧啶、檸檬酸鹽、2-酮戊二酸等的相對含量在照射組與非照射組明顯不同。胸腺嘧啶和尿嘧啶由于是胸苷和2＇-脫氧尿苷的衍生物，與前期研究結(jié)果具有一致性。通過代謝路徑分析發(fā)現(xiàn)，γ射線照射可能影響機(jī)體氧化應(yīng)激和腎功能水平[28-30]。通過UPLC-QTOF/MS大鼠尿液代謝組學(xué)分析，又進(jìn)一步證實了上述化合物作為γ射線輻射損傷嚙齒類動物生物標(biāo)志物的可能性[31]。為了進(jìn)一步的將嚙齒類實驗數(shù)據(jù)與臨床研究相關(guān)聯(lián)，該課題組又對靈長類動物獼猴進(jìn)行尿液輻射代謝組學(xué)研究[32]。研究發(fā)現(xiàn)?；撬帷ⅫS嘌呤、尿酸、肌酐等13個化合物對聚類貢獻(xiàn)明顯，并對這些化合物進(jìn)行了進(jìn)一步的靶標(biāo)代謝組學(xué)研究，明確了其在輻射組與對照組之間的含量差異，并通過受試者工作特征曲線(ROC曲線)評估了其模型判別的準(zhǔn)確性。然而在對前期潛在標(biāo)志物進(jìn)行靶標(biāo)代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這些化合物均沒有顯著差異，分析結(jié)果一方面可能是由于物種之間差異的影響，另一方面提示我們非靶標(biāo)代謝組學(xué)查找到的生物標(biāo)記物需進(jìn)一步經(jīng)過定量驗證來評估其準(zhǔn)確性。

2.2代謝組學(xué)在非電離輻射研究中的應(yīng)用隨著微波技術(shù)的廣泛應(yīng)用，微波輻射作為非電離輻射的常見形式也逐漸得到關(guān)注。長期受到微波輻射的人員會出現(xiàn)精神抑郁、失眠、疲勞、頭痛、激動、多夢、記憶力下降等癥狀[33]。王麗峰等[34]采用NMR代謝組學(xué)研究了微波輻射對獼猴尿液中代謝產(chǎn)物的影響。經(jīng)5和11mM/cm2微波單次輻射和4．68μW/cm2微波30d累積輻射均能引起尿液代謝產(chǎn)物的變化，其差異代謝物包括馬尿酸、檸檬酸、乳酸、甘氨酸、肌酸、肌酐、牛磺酸和苯丙氨酸等。這些代謝物質(zhì)涉及三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物、氨基酸遞質(zhì)代謝產(chǎn)物等，其功能主要涉及線粒體、神經(jīng)遞質(zhì)等，提示低劑量微波長期輻射和高劑量微波一次性輻射均對機(jī)體代謝產(chǎn)生影響。

3展望

代謝組學(xué)應(yīng)用于輻射損傷的研究還處于初級階段，仍然有許多問題需要解決。從近幾年輻射代謝組學(xué)相關(guān)文獻(xiàn)來看，代謝組學(xué)在輻射損傷中的研究，大多集中于生物標(biāo)志物的探索階段，在機(jī)制研究方面仍比較欠缺。從代謝組學(xué)的研究手段上來說，絕大部分仍停留在非靶標(biāo)代謝組學(xué)的輪廓分析，對生物標(biāo)志物的靈敏度與準(zhǔn)確性沒有進(jìn)行進(jìn)一步的定量驗證，從而缺乏有的效說服力。同時，從上述分析中還可以發(fā)現(xiàn)，研究者沒有將代謝組學(xué)數(shù)據(jù)與病理生理學(xué)研究結(jié)果進(jìn)行有效的結(jié)合，在造模階段缺乏有效的病理學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行支撐，在生物標(biāo)志物驗證過程，缺乏對差異化合物的波動原因進(jìn)行有效闡釋。但代謝組學(xué)在輻射損傷研究中全面、高通量、無偏差的優(yōu)勢不容忽視，隨著研究的不斷深入和代謝組學(xué)分析方法的不斷規(guī)范，上述問題終將得到解決。代謝組學(xué)技術(shù)將在輻射損傷的診斷和機(jī)制研究以及輻射損傷防治藥物研究中發(fā)揮積極作用，推動放射醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

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(收稿時間:2015-09-20 修回時間:2015-10-20)

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中國圖書資料分類號] R818.74 A

[文章編號]2095-140X(2015) 12-0113-04

[通訊作者]童衛(wèi)杭，E-mail:sonatawh@163.com

[基金項目]全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項目(14QNP072)

[DOI]10.3969 /j.issn.2095-140X.2015.12.026