超高效液相色譜在中藥及其復(fù)方研究中的應(yīng)用進(jìn)展

盈競(jìng)男 韓新民

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210029）

超高效液相色譜 （ultra performance liquid chromatography，UPLC）法是指一種采用小顆粒填料色譜柱（粒徑小于2μm）和超高壓系數(shù)（壓力大于105kPa）的新型液相色譜技術(shù)，能顯著改善色譜峰的分離度和檢測(cè)靈敏度，同時(shí)大大縮短分析周期，因此特別適用于微量復(fù)雜混合物的分離和高通量研究[1]。中藥及其復(fù)方作為中醫(yī)臨床用藥的主要形式，體現(xiàn)了中醫(yī)整體觀和辨證論治的特色，具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮藥效的特點(diǎn)。且作為一個(gè)高度復(fù)雜的化學(xué)物質(zhì)體系，其復(fù)雜性不僅表現(xiàn)在組成方劑的化學(xué)成分的復(fù)雜性及各組分相互關(guān)系的復(fù)雜性，也體現(xiàn)在方劑與人體相互關(guān)系的復(fù)雜性[2]?，F(xiàn)對(duì)近幾年來(lái)超高效液相色譜在中藥及其復(fù)方研究中的應(yīng)用綜述如下。

1 UPLC法評(píng)價(jià)中藥及其復(fù)方提取工藝

鄧少東等[3]以UPLC法測(cè)定酸水解前后化橘紅中4種黃酮類成分的含量，均達(dá)到良好的分離，認(rèn)為該法高效、快速、靈敏。劉萍等[4]采用UPLC法測(cè)定不同提取工藝提取鉤藤中鉤藤堿含量，結(jié)果表明超臨界CO2萃取方法能在接近常溫條件下工作，提取出的鉤藤堿含量高。王店云等[5]使用UPLC采用正交試驗(yàn)法，考察安神定志靈在不同加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)下的煎出液中黃芩苷的含量變化規(guī)律，確定安神定志靈的最佳煎煮工藝條件。李坤平等[6]采用超高效液相色譜/電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC/EST-TOF-MS）對(duì)玉屏風(fēng)方的水煎煮和超聲提取物的主要化學(xué)成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)水煎煮和超聲得到的2種提取物的色譜圖共有峰12個(gè)，相對(duì)保留時(shí)間一致，說(shuō)明2種方法的提取物化學(xué)成分基本相同，就提取物化學(xué)成分而言，超聲提取技術(shù)適用于玉屏風(fēng)方的制劑生產(chǎn)。陳楊等[7]運(yùn)用正交試驗(yàn)法優(yōu)選黃浦通竅膠囊的提取工藝，以浸膏得出率、浸膏中大黃和石菖蒲有效成分為綜合評(píng)定指標(biāo)，采用UPLC法，得出該制劑最佳提取工藝。汪永忠等[8]使用UPLC法，對(duì)陽(yáng)和平喘顆粒的提取工藝進(jìn)行研究，通過(guò)分析正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法的結(jié)果，得到8倍量的80%乙醇加熱回流提取2次，每次1.5h的最佳提取工藝。趙祥軍等[9]使用UPLC法，以5種生物堿的總量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)左金丸的水提、70%乙醇提取、鹽酸-甲醇（1∶100）提取、半仿生提取方法進(jìn)行比較，認(rèn)為鹽酸-甲醇（1∶100）提取方法優(yōu)于其他3種。

運(yùn)用UPLC法對(duì)各提取工藝進(jìn)行比較，不僅能提高分析效率，節(jié)省分析時(shí)間，減少溶劑損耗，降低分析成本，更能優(yōu)化總結(jié)出最佳提取方案，為中藥及復(fù)方的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立和藥效學(xué)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

2 UPLC法測(cè)定中藥及其復(fù)方有效組分成分、含量

盧林等[10]采用UPLC法測(cè)定地黃中梓醇的含量，在最優(yōu)化條件下，梓醇與其他峰均能達(dá)到基線分離，其色譜峰形好，梓醇的含量在3.06～18.36μg時(shí)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。閆利利等[11]利用超高效液相色譜與串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)（UPLC/Q-TOF-MSE）在相同實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)半夏瀉心湯及其組方各單味藥的色譜圖進(jìn)行比較分析，鑒定了74個(gè)色譜圖，主要成分包括黃酮類、三萜皂苷類、生物堿類、糖苷類，較全面地闡明半夏瀉心湯的化學(xué)組分，為半夏瀉心湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。岑衛(wèi)健等[12]采用UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定益氣養(yǎng)血口服液中淫羊藿苷、黃芪甲苷、黃芪甲苷Ⅱ、五味子醇甲和麥冬皂苷D 5種有效成分含量。在最優(yōu)化條件下，用Agilent Zorbax RRHD E-clipse Plus C18色譜柱，流動(dòng)相為乙腈和0.2%甲酸的水溶液，梯度洗脫，各組分的線性范圍分別為0.003～12mg/L、0.3～12mg/L、0.009～18mg/L、0.006～12mg/L、0.003～3.0mg/L； 檢出限分別為 1μg/L、1μg/L、3μg/L、2μg/L、1μg/L。 何丹等[13]應(yīng)用 UPLC 法測(cè)定藿香正氣口服液中尿苷、鳥(niǎo)苷和腺苷含量，其以ACQUITY UPLC BEH C18為色譜柱，流動(dòng)相為水-甲醇梯度洗脫，柱溫30℃，體積流量0.5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，分析得到尿苷在 10.29～102.9μg/mL、鳥(niǎo)苷在5.73～57.3μg/mL、 腺苷在 5.03～50.3μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。陳曉虎等[14]利用UPLC同時(shí)測(cè)定梔子金花丸中11種成分，色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18，乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脫，被測(cè)定的11種成分色譜峰均有良好的分離度，且有較寬的線性范圍和良好的線性關(guān)系。張紫佳等[15]運(yùn)用UPLC測(cè)定青娥丸中松脂醇二葡萄糖苷的含量。樣品經(jīng)前處理后，采用ACQUITY UPLC BEH C18柱分離，以乙腈-水（使用磷酸調(diào)pH值至4.0，9∶91，v/v）為流動(dòng)相，流速為0.1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為227nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為0.5μL，松脂醇二葡萄糖苷在1.40～506.00mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。施玉旋等[16]以UPLC法測(cè)定“柴胡-白芍”藥對(duì)提取物的3中皂苷類成分。方法是采用Waters XSELECTTM HSS T3色譜柱，0.1%H3PO4水溶液和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，柱溫30℃，流速0.4mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，分析認(rèn)為芍藥苷、柴胡皂苷a及柴胡皂苷d三種成分基本分離，線性關(guān)系良好。

在中藥及復(fù)方化學(xué)成分分析中，經(jīng)常出現(xiàn)樣品含量少，分離難度大，分析耗時(shí)長(zhǎng)的情況，UPLC法能保證分析速度快，分離效率高，檢測(cè)靈敏度高，精密、準(zhǔn)確，更適合應(yīng)用于有效成分及含量的分析。

3 UPLC法檢測(cè)中藥及其復(fù)方的代謝產(chǎn)物

王鈺等[17]采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)分析大鼠灌胃白花蛇舌草環(huán)烯醚萜類提取物后尿液中的E-6-O-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯（M0）及其代謝產(chǎn)物，在大鼠尿液中檢測(cè)到M0、M1（E-6-O-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯葡萄糖醛酸化產(chǎn)物）、M2（對(duì)香豆酸）、M3（對(duì)香豆酸硫酸化產(chǎn)物），其中M1和M3均為首次發(fā)現(xiàn)，分析得到M0在大鼠體內(nèi)以葡萄糖醛酸形式代謝，最終以對(duì)香豆酸及香豆酸硫酸化產(chǎn)物排出體外。薛璟等[18]采用大鼠在體腸灌流實(shí)驗(yàn)，利用UPLC法測(cè)定雷公藤甲素的量，分別研究吸收部位和藥物濃度對(duì)雷公藤甲素吸收的影響。研究結(jié)果表明4.8、3.20pmol/L雷公藤甲素灌流液在各腸段的有效滲透系數(shù)和10cm腸段吸收百分比（10cm%ABS）依次為：十二指腸＞結(jié)腸＞空腸＞回腸，各腸段之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），不同質(zhì)量濃度（4～20μmol/L）的雷公藤甲素在腸道內(nèi)的吸收無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。苗華等[19]基于UPLC-代謝組學(xué)技術(shù)和預(yù)防性給樣法研究澤瀉提取物（AR）結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂血癥的影響，結(jié)果顯示不僅AR結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂血癥有一定的治療作用，且二者聯(lián)用的治療效果優(yōu)于單一AR組或有氧運(yùn)動(dòng)組。鄭林等[20]給大鼠靜脈注射和口服細(xì)辛-芍藥提取物后，用UPLC-MS同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中野黃芩苷和芍藥苷含量，研究2種指標(biāo)成分在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征及其絕對(duì)生物利用度。結(jié)果表明，野黃芩苷和芍藥苷2種成分呈良好的線性關(guān)系（r＞0.999），絕對(duì)生物利用度分別為26.448%和5.38%。辛楊等[21]以黑順片單煎液及其復(fù)方煎煮液“術(shù)附湯”和“甘草附子湯”灌胃，以大鼠血漿中的次烏頭堿為檢測(cè)指標(biāo)，采用UPLC/Q-TOF MS方法，并以內(nèi)標(biāo)法對(duì)其進(jìn)行了含量測(cè)定，方法學(xué)考察結(jié)果表明血中次烏頭堿在0.02～10ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，而“甘草附子湯”中的某種或某些成分促進(jìn)了次烏頭堿的體內(nèi)吸收，兩復(fù)方功效差異可能來(lái)源于次烏頭堿在體內(nèi)吸收的不同。

運(yùn)用UPLC法，可通過(guò)分析中藥及復(fù)方在體內(nèi)代謝成分，探索其藥效作用的更直接作用成分，為進(jìn)一步闡明其物質(zhì)基礎(chǔ)提供研究方向。

4 UPLC法建立中藥及其復(fù)方的指紋圖譜

馬培等[22]利用Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱，乙腈-0.5%乙酸水溶液梯度洗脫，流速為0.3mL/min，紫外吸收波長(zhǎng)為290nm，建立了38批不同產(chǎn)地虎杖藥材的UPLC指紋圖譜。結(jié)果顯示該批次虎杖藥材共有11個(gè)共有峰，其中4個(gè)共有峰為虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚。36批虎杖藥材相似度＞0.9，2批藥材相似度為0.733、0.896。劉芷等[23]首次建立了五味子的UPLC指征指紋圖譜共有模式，標(biāo)定了21個(gè)共有峰，結(jié)合保留時(shí)間和紫外光譜分析，指認(rèn)了五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子γ乙素、五味子乙素和五味子丙素的峰位。19批五味子的相似度均在0.970以上。王露黔等[24]采用UPLC-PDA-ELSD法建立消渴顆粒的指紋圖譜，分別以芒果苷和知母皂苷BⅡ?yàn)閰⒄辗?，確定了23個(gè)紫外檢測(cè)共有指紋峰和10個(gè)蒸發(fā)檢測(cè)共有指紋峰。結(jié)果證實(shí)19批消渴清顆粒合格，9批不合格；8批消渴清顆粒中有5個(gè)主要成分的量有異常，定量測(cè)定與指紋圖譜結(jié)果具有一致性，可作為消渴清顆粒的質(zhì)量控制依據(jù)。張寧等[25]利用UPLC-MS對(duì)自制10批地黃飲子樣品進(jìn)行成分分析，共標(biāo)定了30個(gè)共有色譜峰，通過(guò)與對(duì)照品的保留時(shí)間及一級(jí)質(zhì)譜信息的比對(duì)，確定了馬錢苷、松果菊苷、烏頭堿、新烏頭堿、五味子醇甲、五味子乙素和茯苓素，所制定的指紋圖譜特征性及專屬性強(qiáng)，可結(jié)合含量測(cè)定用于全面控制地黃飲子的質(zhì)量。

目前，指紋圖譜已經(jīng)成為國(guó)際公認(rèn)的中藥或天然藥物質(zhì)量控制最有效的方法之一。近些年來(lái)色譜技術(shù)發(fā)展，超高效液相色譜具有較好的分離效率、峰容量及靈敏度，作為一種新的色譜技術(shù)應(yīng)用于中藥及復(fù)方指紋圖譜的測(cè)定研究有著非常廣闊的前景。

5 討論

中藥及復(fù)方具有組分多、有效成分含量低、各組分物理化學(xué)性質(zhì)各異的特點(diǎn)，且大多對(duì)環(huán)境（如溫度、pH值等）敏感。近年來(lái)隨著分析化學(xué)和儀器設(shè)備的發(fā)展，一些新型的分析方法被應(yīng)用到中藥及復(fù)方研究領(lǐng)域中來(lái)，如化學(xué)定量法、紫外分光光度法、薄層掃描法、氣相色譜法、高效液相色譜法等?；瘜W(xué)定量法適用于單味中藥制劑或復(fù)方中含量較高的一些成分及含礦物藥制劑中的無(wú)機(jī)成分的含量測(cè)定，但其靈敏度低、操作煩瑣、主屬性差，故不適用于制劑中單體成分、微量及痕量的測(cè)定。紫外分光光度法是通過(guò)測(cè)定吸收度來(lái)計(jì)算含量的方法，該法靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)單，但是準(zhǔn)確度相對(duì)不高。薄層掃描法進(jìn)行定性分析，比較直觀、快速、準(zhǔn)確，但定量分析無(wú)論準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性還是精密度上都不好，故已取消其定量分析。氣相色譜具有分離能力好、靈敏度高、分析速度快、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，但是受技術(shù)條件的限制，沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都無(wú)法采用其進(jìn)行分析。高效液相色譜法（HPLC）主要是利用要測(cè)定的指標(biāo)成分與其他組分在流動(dòng)相與固定相中的分配系數(shù)不同而把指標(biāo)成分分離出來(lái)并進(jìn)行含量測(cè)定，具有分離效率高、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性好、分析速度快、選擇性優(yōu)和靈敏度高的特點(diǎn)，且不受樣品揮發(fā)性的限制，對(duì)于高沸點(diǎn)、熱源穩(wěn)定性差的有機(jī)物都可應(yīng)用。故目前在中藥及其復(fù)方定性及定量研究方面，HPLC使用的最為廣泛。超高效液相色譜（UPLC）基于HPLC技術(shù)，采用1.7μm顆粒度的色譜柱填料，能獲得更高的柱效，并且在更寬的線速范圍內(nèi)柱效保持恒定，因而有利于提高流動(dòng)相流速，縮短分析時(shí)間，提高分析通量，為復(fù)雜體系的分離分析提供了良好的平臺(tái)。在分析結(jié)果的質(zhì)量、時(shí)效性、成本等方面，UPLC較傳統(tǒng)或優(yōu)化的HPLC更出色，故越來(lái)越多的研究者采用超高效液相色譜。

隨著藥物分析方法的發(fā)展，UPLC將會(huì)在藥物及其復(fù)方分析領(lǐng)域中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，其能夠快速、精確的對(duì)中藥及復(fù)方提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，測(cè)定有效成分及含量，分析藥物體內(nèi)代謝產(chǎn)物，制定指紋圖譜。但是UPLC在實(shí)際應(yīng)用中也存在一些問(wèn)題，如由于進(jìn)樣量過(guò)少，且采用半環(huán)進(jìn)樣的方式，導(dǎo)致峰面積的重復(fù)性略差，而且由于填料顆粒極細(xì)，導(dǎo)致UPLC柱易堵塞等。但是隨著進(jìn)樣技術(shù)、填料技術(shù)等進(jìn)一步發(fā)展，這些不足將會(huì)得到進(jìn)一步克服。在實(shí)際研究過(guò)程中，許多研究者將UPLC與質(zhì)譜聯(lián)用，其高效性、高靈敏度能快速完成眾多復(fù)雜成分的分離與鑒定，不僅能夠做定性、定量檢測(cè)，而且能夠提供一些分子結(jié)構(gòu)信息。因目前單體對(duì)照物有限，故在實(shí)驗(yàn)中對(duì)于某些不明的單體或新化合物不能馬上明確其成分，可以以UPLC為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測(cè)系統(tǒng)，二者聯(lián)用經(jīng)檢測(cè)器得到質(zhì)譜圖，提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息，推算出其化學(xué)式，有助于明確其化學(xué)成分。通過(guò)聯(lián)用技術(shù)既可建立中藥及其復(fù)方的指紋圖譜，又可進(jìn)行多種有效成分或指標(biāo)成分定量，還可用于體內(nèi)藥物分析，為我們研究中藥及復(fù)方的有效成分及新藥的開(kāi)發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

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