李士偉， 李 想， 關(guān) 鋒 △

(江南大學(xué) 1糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 2生物工程學(xué)院， 3無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

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NF-κB參與枸櫞酸鐵銨過載誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞hepcidin基因表達(dá)

李士偉1, 2， 李 想3， 關(guān) 鋒1, 2 △

(江南大學(xué)1糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2生物工程學(xué)院，3無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

目的： 研究核因子κB(NF-κB)在枸櫞酸鐵銨過載誘導(dǎo)人肝細(xì)胞鐵調(diào)素(hepcidin)基因表達(dá)中的調(diào)控作用。方法: 依據(jù)前期不同濃度枸櫞酸鐵銨抑制人肝細(xì)胞HH4增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取0.1、1、5和10 mmol/L枸櫞酸鐵銨處理人肝細(xì)胞HH4 48 h，半定量PCR法檢測(cè)胞內(nèi)hepcidin的表達(dá)水平；利用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)、電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)和雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，并結(jié)合胞內(nèi)NF-κB活性抑制實(shí)驗(yàn)，確定NF-κB對(duì)人hepcidin轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果: 5 mmol/L和10 mmol/L濃度的枸櫞酸鐵銨處理細(xì)胞后，hepcidin表達(dá)水平顯著增強(qiáng)；ChIP和EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)NF-κB能夠與hepcidin基因啟動(dòng)子結(jié)合；重組螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒TOPFlash-pHepcidin相對(duì)螢光素酶活性明顯高于對(duì)照組；與重組質(zhì)粒TOPFlash-pHepcidin相比，突變重組螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒TOPFlash-pHepcidin-mut相對(duì)螢光素酶活性顯著降低；NF-κB抑制劑BAY 11-7082顯著降低了hepcidin基因的表達(dá)。結(jié)論: NF-κB參與了鐵過載誘導(dǎo)的人hepcidin基因表達(dá)。這為進(jìn)一步深入研究肝細(xì)胞鐵過載模式下多因子協(xié)同調(diào)控hepcidin基因表達(dá)的具體分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

核因子κB； 染色質(zhì)免疫共沉淀； 電泳遷移率實(shí)驗(yàn)； 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)； 鐵調(diào)素

鐵調(diào)素(hepcidin)是一種肝臟分泌的在維持機(jī)體鐵代謝平衡中起關(guān)鍵性調(diào)控作用的小分子多肽[1]。2001年，2個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室首先從人的血液和尿液中將hepcidin純化出來[2]。Hepcidin蛋白與十二指腸、巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞細(xì)胞膜上的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ferroportin，F(xiàn)PN)結(jié)合，誘使FPN內(nèi)化和泛素化降解，從而抑制肝臟和腸道對(duì)鐵的吸收以及單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)鐵的釋放，起到維持體內(nèi)鐵平衡作用[3-4]。研究表明機(jī)體鐵狀況、貧血、缺氧、細(xì)菌、致炎物質(zhì)和細(xì)胞因子等均可影響hepcidin的表達(dá)水平[5-8]。

Hepcidin蛋白由hepcidin基因編碼，該基因位于人的19號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上(19q13)，全長(zhǎng)為2.5 kb，含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，mRNA長(zhǎng)度為0.4 kb。Hepcidin基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，多種因素均可影響其表達(dá)水平。已經(jīng)明確的是3個(gè)信號(hào)通路影響肝臟hepcidin基因的表達(dá)，BMP與Smad4途徑、IL-6與STAT3途徑和TfR2與HFE途徑[9-10]。此外，hepcidin基因的上游調(diào)控區(qū)還存在多個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如USF2、STAT3、CCAAT/增強(qiáng)子、核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)、肝核因子42和p53等[11-12]。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)體外枸櫞酸鐵銨(ferric ammonium citrate，F(xiàn)AC)超載引起人肝細(xì)胞HH4胞內(nèi)NF-κB和hepcidin基因表達(dá)水平的顯著上調(diào)，提示NF-κB可能與鐵過載激發(fā)hepcidin基因的過度表達(dá)有密切關(guān)系。因此，通過染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)、電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)和雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)以及胞內(nèi)NF-κB活性抑制實(shí)驗(yàn)以期確證NF-κB參與人肝細(xì)胞hepcidin轉(zhuǎn)錄調(diào)控的可能性，為進(jìn)一步深入研究鐵過載模式下hepcidin表達(dá)的多分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

非轉(zhuǎn)化人肝細(xì)胞株HH4由美國西雅圖Fred-Hutchinson Cancer Research Center的Joachim Deeg教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒M50 Super 8x TOPFlash、M51 Super 8x FOPFlash(TOPFlash mutant)、海腎螢光素酶對(duì)照?qǐng)?bào)告基因質(zhì)粒pRL-TK及大腸桿菌JM109由本室保存。

Williams’ Medium E、HEPES和丙酮酸鈉(Gibco)；胎牛血清和青霉素溶液(Life Technologies)；地塞米松、慶大霉素和枸櫞酸鐵銨(Sigma)；胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(insulin-transferrin-selenium, ITS)添加劑(BD)；細(xì)胞RNA提取試劑盒和Nc-細(xì)胞核/漿蛋白抽提試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；ReverTra Ace -α-逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO)；PfuDNA聚合酶、細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒和Pro-Light HRP 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑(天根生化科技有限公司)；Protein A/G PLUS-Agarose(Santa Cruz)；DIG Gel Shift Kit(Roche)；KpnI和BglII內(nèi)切酶、1 kb DNA Ladder marker、DL2000 DNA Ladder marker和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TaKaRa)；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)(Promega)；96孔黑色細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning)；T-PER組織總蛋白抽提試劑(Thermo)；NF-κB抑制劑BAY 11-7082、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 抗體(碧云天生物技術(shù)研究所)；p-IκBα、NF-κB p65和p-NF-κB p65抗體(Cell Signalling)；抗hepcidin-25抗體(Abcam)。引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

HH4細(xì)胞在含10% 胎牛血清、0.1% ITS、0.04 mg/L地塞米松、50 mg/L慶大霉素、20 mmol/L 的HEPES和1 mmol/L 的丙酮酸鈉的Williams培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2、95%相對(duì)濕度。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 半定量RT-PCR檢測(cè)hepcidin表達(dá)水平 0.1、1、5和10 mmol/L枸櫞酸鐵銨分別處理HH4細(xì)胞48 h，提取HH4細(xì)胞總RNA并在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA。根據(jù)NCBI中的人hepcidin基因設(shè)計(jì)合適的半定量RT-PCR引物。上游引物序列為5’-CTGTTTTCCCACAACAGAC-3’，下游引物序列為5’-CCTTCCTTATTTATTCCTGC-3’，擴(kuò)增片段全長(zhǎng)230 bp。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

3.2 ChIP和EMSA實(shí)驗(yàn) 選取5 mmol/L FAC濃度處理HH4細(xì)胞48 h，加入終濃度1%的甲醛，37 ℃交聯(lián)固定DNA與蛋白質(zhì)10 min。收集細(xì)胞用SDS lysis buffer重懸，3 s工作7 s間歇超聲波破碎細(xì)胞，重復(fù)150次。離心取上清，將獲取的100 μL上清作為input組存于-80 ℃待用。另取100 μL上清加入NF-κB p65抗體，4 ℃顛轉(zhuǎn)過夜處理。加入Protein A/G 4 ℃繼續(xù)顛轉(zhuǎn)4 h，離心收集沉淀(結(jié)合的DNA和蛋白質(zhì))。與input組同時(shí)用5 mol/L NaCl 65 ℃解交聯(lián)4 h，DNA純化試劑盒純化后溶于30 μL洗脫液中。針對(duì)hepcidin基因上游啟動(dòng)子區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增包含轉(zhuǎn)錄因子NF-κB假定識(shí)別序列的153 bp片段，以確定NF-κB和hepcidin的結(jié)合：正向引物5’-TGGGACTACAGATGTGTGC-3’；反向引物5’-GCCTGTAATCCCAGCAAT-3’。

選取5 mmol/L FAC濃度處理HH4細(xì)胞48 h，然后按試劑盒說明書提取核蛋白并用BCA法定量。將NF-κB識(shí)別的特異性互補(bǔ)寡核苷酸片段在TEN buffer中按摩爾比1∶ 1混勻，95 ℃變性10 min后，緩慢復(fù)性：正向序列為5’-TAGAGATGGGGTCTCCCTATGT-3’；反向序列為5’-ACATAGGGAGACCCCATCTCTA-3’。按DIG Gel Shift Kit說明書將雙鏈DNA標(biāo)記地高辛。取50 μg核蛋白與標(biāo)記地高辛的雙鏈DNA混合, 在25 ℃反應(yīng)30 min。5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳后的凝膠經(jīng)電轉(zhuǎn)至尼龍膜，254 nm紫外交聯(lián)固定10 min。按照DIG Gel Shift Kit試劑盒免疫雜交信號(hào)檢測(cè)操作程序進(jìn)行檢測(cè)。在超遷移分析實(shí)驗(yàn)中，取2 μg NF-κB p65抗體與核蛋白25 ℃反應(yīng)20 min，然后加入標(biāo)記地高辛的雙鏈DNA。

3.3 雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)實(shí)驗(yàn) 根據(jù)NCBI中的人hepcidin基因5’上游啟動(dòng)子區(qū)序列設(shè)計(jì)合適的引物構(gòu)建螢光素酶報(bào)告載體TOPFlash-pHepcidin。上游引物序列hepcidin-F為5’-GGGGTACCCCACCACGCCTGGCTAAA-3’，引入酶切位點(diǎn)KpnI，下游引物序列hepcidin-R為5’-GAAGATCTCGTGCCGTCTGTCTGGCT-3’，引入酶切位點(diǎn)BglII。提取HH4細(xì)胞基因組DNA，以其為模板PCR擴(kuò)增hepcidin基因5’上游846 bp片段pHepcidin。PCR 擴(kuò)增體系為5×Prime STAR 緩沖液10 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，上游引物(20 μmol/L)1 μL，下游引物(20 μmol/L) 1 μL，Prime STAR DNA 聚合酶0.3 μL，模板DNA 1 μL，滅菌蒸餾水32.7 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化，然后用KpnI和BglII雙酶切。酶切產(chǎn)物純化后，與同樣經(jīng)KpnI和BglII雙酶切處理的M50 Super 8x TOPFlash載體在16 ℃下用T4 DNA Ligase連接過夜，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中，在含有氨芐青霉素的LB固體平板上37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取生長(zhǎng)的單菌落提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定，獲得構(gòu)建成功的TOPFlash-pHepcidin載體。

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HH4細(xì)胞以108/L接種至24孔板進(jìn)行報(bào)告基因載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞生長(zhǎng)至約70 %融合時(shí)，利用LipofectamineTM2000試劑將0.8 μg的重組質(zhì)粒TOPFlash-pHepcidin、0.8 μg的重組質(zhì)粒TOPFlash-pHepcidin-mut或0.8 μg的陰性對(duì)照質(zhì)粒FOPFlash和0.1 μg的內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染HH4細(xì)胞，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染6 h后更換含10% FBS的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h之后，將細(xì)胞分為2組，其中一組更換5 mmol/L FAC培養(yǎng)基，另一組更換正常培養(yǎng)基。12 h后，使用雙螢光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒裂解收集細(xì)胞。

雙螢光素酶活性測(cè)定按照Promega 公司提供的Dual-luciferase reporter assay system操作說明進(jìn)行。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用1×PBS液漂洗細(xì)胞2次。每孔加100 μL 1×PLB細(xì)胞裂解液，室溫?fù)u動(dòng)孵育15 min裂解細(xì)胞。取50 μL細(xì)胞裂解液加入96孔黑色細(xì)胞培養(yǎng)板。使用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行雙螢光素酶活性測(cè)定，自動(dòng)進(jìn)樣器1 和2 分別充滿LARII 和Stop&Glo?試劑。測(cè)量時(shí)，使用 2 s延遲和10 s螢光累積讀數(shù)。各實(shí)驗(yàn)組啟動(dòng)子活性用相對(duì)螢光素酶值(relative luciferase activity，RLA)表示。

3.4 NF-κB活性抑制實(shí)驗(yàn) HH4細(xì)胞以2×108/L傳至6孔板，過夜培養(yǎng)后， 0.1 μmol/L NF-κB抑制劑BAY 11-7082處理5 h。收集細(xì)胞, 加入T-PER組織總蛋白抽提試劑在4 ℃裂解細(xì)胞30 min，離心取上清，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。樣品加入5×蛋白上樣緩沖液混合，煮沸5 min, 取20 μg蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE；電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至0. 45 μm PVDF膜，用5 % 脫脂奶粉室溫封閉2 h；隨后加入 I 抗(1∶ 1 000)，4 ℃孵育12 h，用1×TBST洗5次；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II抗(1∶5 000), 室溫作用1 h, 用1×TBST洗5次, 然后用Pro-Light HRP化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑顯色，用Bio-Rad Chemi DocTMXRS+系統(tǒng)掃描成像。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 枸櫞酸鐵銨提高HH4胞內(nèi)hepcidin表達(dá)水平

不同濃度枸櫞酸鐵銨作用于HH4細(xì)胞48 h后，hepcidin表達(dá)水平與對(duì)照組相比呈濃度依賴性升高。其中，5 mmol/L和10 mmol/L組hepcidin表達(dá)水平顯著上調(diào)，見圖1。

Figure 1.Different concentrations of FAC induced upregulation of hepcidin expression in HH4. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group(0 mmol/L).

圖1 不同濃度FAC誘導(dǎo)HH4胞內(nèi)Hepcidin表達(dá)上調(diào)

2 NF-κB與hepcidin上游啟動(dòng)子結(jié)合作用的分析

研究揭示轉(zhuǎn)錄因子NF-κB特異性結(jié)合目標(biāo)基因啟動(dòng)區(qū)內(nèi)一段10 bp的保守序列GGGRNNYYCC，其中R表示嘌呤，Y表示嘧啶，N代表任意的堿基。本研究利用在線轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具SiteGA 對(duì)人hepcidin基因5’端序列潛在的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，結(jié)果在hepcidin基因啟動(dòng)子區(qū)域起始位點(diǎn)上游-3 000 bp到起始位點(diǎn)下游100 bp共3 100 bp范圍內(nèi)(hepcidin_1|NC_000019 35770435…35773535)檢測(cè)到一個(gè)可能的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB結(jié)合位點(diǎn)：GGGAGACCCC(-785…-776)。

生物信息學(xué)分析提示hepcidin上可能存在NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，而本文ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示hepcidin啟動(dòng)子區(qū)引物分別以5 mmol/L實(shí)驗(yàn)組和input組DNA為模板均能擴(kuò)增出大小正確的條帶，且前者灰度值弱于后者，這一結(jié)果表明NF-κB能夠與hepcidin啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生特異性結(jié)合，與預(yù)測(cè)結(jié)果相一致，見圖2A。同時(shí)在EMSA實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)地高辛標(biāo)記雙鏈探針與核蛋白結(jié)合的滯后條帶(泳道2)，經(jīng)120倍的冷探針競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合后，滯后條帶明顯減弱(泳道3)，當(dāng)在反應(yīng)體系中同時(shí)加入NF-κB p65的抗體后又出現(xiàn)了一條更為滯后的條帶(泳道4)，即DNA/NF-κB/NF-κB p65抗體所形成的超遷移帶。EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在體外可以和hepcidin啟動(dòng)子上的寡核苷酸序列相結(jié)合，見圖2 B。

Figure 2.NF-κB binding tohepcidinpromoter region. NF-κB binding to thehepcidinpromoter was analyzed using ChIP and EMSA assays utilizing anti-NF-κB p65 after 48 h of FAC treatment. A: ChIP experiment. ChIP-hepcidin, 153 bp fragment from -848 to -694 inhepcidinpromoter. Input represents amplification ofhepcidinpromoter regions using cell lysates without immunoprecipitation. B: EMSA experiment.

圖2 ChIP和EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)NF-κB結(jié)合hepcidin上游啟動(dòng)子區(qū)

3 螢光素酶報(bào)告載體TOPFlash-pHepcidin的構(gòu)建

為進(jìn)一步檢測(cè)NF-κB對(duì)HH4胞內(nèi)hepcidin表達(dá)的調(diào)控，本研究構(gòu)建人hepcidin啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告載體并對(duì)重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HH4后的螢光活性進(jìn)行分析。在TOPFlash-pHepcidin構(gòu)建中，以HH4細(xì)胞基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出大小約846 bp的hepcidin基因5’上游片段。將啟動(dòng)子片段克隆到TOPFlash螢光素酶報(bào)告基因載體中, 獲得重組質(zhì)粒TOPFlash-pHepcidin。重組質(zhì)粒經(jīng)KpnI和BglII雙酶切發(fā)現(xiàn)一長(zhǎng)度約846 bp的片段，與預(yù)計(jì)一致。測(cè)序結(jié)果證實(shí)與GenBank中人hepcidin基因啟動(dòng)子序列一致，表明人hepcidin基因啟動(dòng)子報(bào)告基因載體TOPFlash-pHepcidin構(gòu)建成功，見圖3。

Figure 3.Construction of recombinant plasmid TOPFlash-pHepcidin. A: PCR amplification of humanhepcidinpromoter region. The M: DL2000 DNA ladder marker; Lane 1： PCR product of humanHepcidinpromoter. B: identification of recombinant plasmid by dual enzyme digestion. M1： DL2000 DNA ladder marker; Lanes 1, 2 and 3： enzymeKpnI &BglII digestion of 1, 2 and 3 positive transformants plasmid TOPFlash-pHepcidin; M2： 1 kb DNA ladder marker. C: the plasmid map of M50 Super 8x TOPFlash-pHepcidin.

圖3 重組質(zhì)粒TOPFlash-pHepcidin的構(gòu)建

4 突變螢光素酶報(bào)告載體TOPFlash-pHepcidin-mut的構(gòu)建

Figure 4.Sequencing map near NF-κB conserved sites of recombinant plasmid TOPFlash-pHepcidin/TOPFlash-pHepcidin-mut. A: sequencing map of recombinant plasmid TOPFlash-pHepcidin; B: sequencing map of recombinant plasmid TOPFlash-pHepcidin-mut.

圖4 重組質(zhì)粒TOPFlash-pHepcidin和TOPFlash-pHepcidin-mut上NF-κB保守位點(diǎn)附近的測(cè)序圖譜

5 人Hepcidin基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)

TOPFlash/FOPFlash是在Wnt信號(hào)通路中比較常用的檢測(cè)β-catenin表達(dá)的系統(tǒng)，它利用轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合靶位點(diǎn)進(jìn)而啟動(dòng)下游的螢火蟲螢光素酶基因的表達(dá)。其中，F(xiàn)OPFlash載體是包含突變的TCF/LEF DNA結(jié)合位點(diǎn)的對(duì)照質(zhì)粒。從圖5中可以看出，相對(duì)于內(nèi)參對(duì)照組的FOPFlash質(zhì)粒，所有5 mmol/L FAC處理和未處理的重組質(zhì)粒組的相對(duì)螢光素酶活性在HH4細(xì)胞中均顯著增高。同時(shí)，與未處理的重組質(zhì)粒組相比，5 mmol/L FAC的處理能夠使得螢光素酶的表達(dá)進(jìn)一步增加。此外，與正常螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒TOPFlash-pHepcidin相比，突變螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒TOPFlash-pHepcidin-mut的相對(duì)螢光素酶活性下降了約40%和55%。這些結(jié)果表明，在HH4細(xì)胞中，NF-κB可以通過與人hepcidin基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合而調(diào)控hepcidin基因的表達(dá)。

Figure 5.The effect of NF-κB on transcriptional activity of humanhepcidinpromoter. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsTOPFlash;##P<0.01vsTOPFlash-pHepcidin;△△P<0.01vsTOPFlash-pHepcidin-mut.

圖5 NF-κB對(duì)人hepcidin基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響

6 抑制NF-κB的DNA結(jié)合活性對(duì)hepcidin表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在HH4細(xì)胞中參與了hepcidin的表達(dá)調(diào)控，利用NF-κB抑制劑BAY11-7082抑制NF-κB的DNA結(jié)合活性，然后觀察hepcidin的表達(dá)水平。抑制劑BAY11-7082能抑制NF-κB的上游激活蛋白IκB的活性，從而間接影響NF-κB的活化。從圖6可以看出，BAY11-7082處理HH4細(xì)胞5 h后，p-IκBα、p-NF-κB和hepcidin蛋白的表達(dá)水平均明顯受到抑制。

Figure 6.The effect of the NF-κB inhibitor BAY 11-7082 on hepcidin expression in HH4 cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖6 BAY 11-7082在HH4細(xì)胞對(duì)hepcidin表達(dá)水平的抑制作用

Figure 7.Schematic representation of hepcidin expression suppression induced by BAY 11-7082 in HH4.

圖7 BAY 11-7082抑制胞內(nèi)hepcidin蛋白表達(dá)示意圖

討 論

Hepcidin是機(jī)體鐵吸收和代謝調(diào)控的關(guān)鍵效應(yīng)分子，它的表達(dá)受鐵貯存、低氧、炎癥或細(xì)胞因子等多重信號(hào)直接或者間接調(diào)節(jié)[13]。Hepcidin表達(dá)紊亂會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的病理性鐵代謝紊亂，因此hepcidin表達(dá)的嚴(yán)密調(diào)控對(duì)維持體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的平衡十分必要[14]。但是，當(dāng)前對(duì)hepcidin表達(dá)的具體調(diào)控機(jī)制尚不十分清楚。

轉(zhuǎn)錄因子NF-κB廣泛參與機(jī)體各種組織細(xì)胞中眾多基因的轉(zhuǎn)錄[15]。NF-κB最早是從B淋巴細(xì)胞的核抽提物中發(fā)現(xiàn)的一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強(qiáng)子上一段10 bp序列特異性結(jié)合的核蛋白因子[16]。NF-κB是由5種亞單位組成的同質(zhì)的或異質(zhì)的二聚體，包括NF-κB1(p50和它的前體p105)、NF-κB2(p52和它的前體p100)、 p65(也被稱為RelA)c-Rel 和 RelB。其中，p50/p65是最常見的NF-κB二聚體形式[17]。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)鐵過載引發(fā)HH4細(xì)胞內(nèi)NF-κB和hepcidin的表達(dá)上調(diào)，推測(cè)兩者在表達(dá)上可能存在緊密的聯(lián)系。本研究利用轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)工具SiteGA檢測(cè)到hepcidin基因上游區(qū)存有潛在的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，隨后的染色質(zhì)免疫共沉淀和電泳遷移率變更實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄因子NF-κB可以特異性結(jié)合hepcidin啟動(dòng)子上的寡核苷酸序列。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒TOPFlash-pHepcidin螢光素酶活性顯著高于內(nèi)參質(zhì)粒FOPFlash，而NF-κB保守結(jié)合位點(diǎn)的突變則引起了重組質(zhì)粒TOPFlash-pHepcidin-mut螢光素酶活性的顯著下降。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制劑BAY11-7082不但能顯著影響胞內(nèi)IκB和NF-κB的磷酸化，同時(shí)也導(dǎo)致了下游蛋白hepcidin表達(dá)的顯著下調(diào)。

綜上所述，F(xiàn)AC過載可以誘導(dǎo)HH4細(xì)胞hepcidin表達(dá)上調(diào)。本研究同時(shí)利用ChIP和EMSA實(shí)驗(yàn)表明NF-κB能夠結(jié)合hepcidin上游啟動(dòng)子區(qū)。此外，實(shí)驗(yàn)通過成功克隆人hepcidin基因上游啟動(dòng)子區(qū)，構(gòu)建人hepcidin基因啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告載體TOPFlash-pHepcidin和TOPFlash-pHepcidin-mut，以及利用BAY11-7082抑制胞內(nèi)NF-κB等方法，確證了鐵過載模式下NF-κB對(duì)HH4細(xì)胞hepcidin表達(dá)的調(diào)控作用?；趆epcidin表達(dá)受到多種因素的影響，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)進(jìn)一步研究多因子協(xié)同調(diào)控hepcidin表達(dá)機(jī)制，以及揭示體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控的具體分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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NF-κB participates inhepcidinup-regulation induced by iron overload in HH4 hepatocytes

LI Shi-wei1, 2, LI Xiang3, GUAN Feng1, 2

(1KeyLaboratoryofCarbohydrateChemistry&Biotechnology,MinistryofEducation， 2SchoolofBiotechnology，3WuxiMedicalSchool,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China.E-mail:fengguan@jiangnan.edu.cn)

AIM: To study the effects of nuclear factor kappa B (NF-κB) on humanhepcidinexpression in ferric ammonium citrate (FAC)-induced HH4 hepatocytes. METHODS: Non-transformed HH4 cells were exposed to FAC at concentrations of 0.1, 1, 5 and 10 mmol/L for 48 h. The expression of iron regulatory genehepcidinwas determined by semi-quantitative RT-PCR. The effects of NF-κB onhepcidintranscriptional activity were detected using chromatin immunoprecipitation (ChIP), electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and dual-luciferase reporter assay system, combined with the inhibition experiments of intracellular NF-κB activity. RESULTS: FAC at concentrations of 5 mmol/L and 10 mmol/L significantly enhanced the expression ofhepcidin. The results of ChIP and EMSA showed the binding of NF-κB to the upstream ofhepcidinpromoter. Treatment with NF-κB inhibitor BAY 11-7082 attenuatedhepcidinexpression. The luciferase activity in the cells transfected with recombinant luciferase reporter plasmid was obviously higher than that in control group.CONCLUSION: NF-κB is the transcription factor that contributes tohepcidinexpression in iron overload-induced HH4 cells.

Nuclear factor κB; Chromatin immunoprecipitation; Electrophoretic mobility shift assay; Dual-luciferase reporter assay system; Hepcidin

1000- 4718(2015)04- 0695- 07

2014- 10- 22

2014- 12- 25

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.022

△通訊作者 Tel: 0510-86918126; E-mail: fengguan@jiangnan.edu.cn