黃方志， 沈玉華， 李士闊， 謝安建

(安徽大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院， 安徽 合肥 230039)

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果汁中維生素C熒光法測(cè)定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與教學(xué)探索

黃方志， 沈玉華， 李士闊， 謝安建

(安徽大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院， 安徽 合肥 230039)

通過(guò)果汁中維生素C的熒光法測(cè)定實(shí)驗(yàn)，學(xué)生不僅能掌握正交設(shè)計(jì)法以及樣品前處理方法，還能更好地理解和掌握熒光的分析原理、操作方法、定性、定量方法及其在化合物檢測(cè)分析研究中的重要性。經(jīng)過(guò)幾年的教學(xué)實(shí)踐、探索與完善，教學(xué)成效已初步顯現(xiàn)。

熒光分光光度法； 化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)； 實(shí)驗(yàn)教學(xué)； 創(chuàng)造性思維

0 引 言

維生素C在人體內(nèi)不能合成, 只能從食物和藥物中攝取，因此, 食品、藥物中維生素C的分析與測(cè)定具有重要意義[1-9]。在Deutsch和Weeks報(bào)道的維生素C 的經(jīng)典熒光分析檢測(cè)法(OPDA)的基礎(chǔ)上，結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，構(gòu)建了一例簡(jiǎn)便易行、結(jié)果明顯、樣品處理簡(jiǎn)單、快速,體系穩(wěn)定性好，并能與分析化學(xué)理論知識(shí)緊密結(jié)合的化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)以日常生活中常見(jiàn)的飲品為原料，貼近生活，激發(fā)了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)激情與主動(dòng)性。將經(jīng)典的熒光分析法與正交設(shè)計(jì)結(jié)合起來(lái)，使學(xué)生在掌握熒光分析法基礎(chǔ)知識(shí)和基本技能的同時(shí)，培養(yǎng)他們的創(chuàng)新思維。

化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)是針對(duì)分析化學(xué)專(zhuān)業(yè)高年級(jí)本科生開(kāi)設(shè)的，在本科畢業(yè)論文開(kāi)始之前，設(shè)計(jì)6個(gè)化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)，通過(guò)幾個(gè)典型的綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)，使學(xué)生系統(tǒng)地掌握分析化學(xué)專(zhuān)業(yè)綜合知識(shí)，達(dá)到對(duì)知識(shí)的融會(huì)貫通。共安排48學(xué)時(shí)，一個(gè)班分成6個(gè)大組，每大組分成4個(gè)小組，每小組2或1人，其中熒光分析儀器有2臺(tái)，實(shí)驗(yàn)采用循環(huán)模式。整個(gè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程包括，引導(dǎo)學(xué)生如何完善具體的實(shí)驗(yàn)方案以及實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的前處理；借助正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)在有限的時(shí)間內(nèi)完成樣品測(cè)試最佳實(shí)驗(yàn)條件的確定；各種試劑的配制；試樣的處理與測(cè)試機(jī)理以及影響測(cè)試結(jié)果的因素、定性定量方法等。

1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解樣品前處理的方法，掌握分子熒光分析法的基本原理及其儀器組成，掌握正交設(shè)計(jì)的基本方法及應(yīng)用，熟悉熒光法測(cè)定食品中維生素C含量的方法。

1.2 實(shí)驗(yàn)原理

熒光是物質(zhì)吸收光的能量后產(chǎn)生的，因此任何熒光物質(zhì)都具有兩種光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。

維生素C本身無(wú)明顯的熒光效應(yīng)，因此，需要預(yù)先處理。維生素C先被活性炭(Norit)氧化為脫氫抗壞血酸(DHAA)，DHAA再與熒光底物鄰苯二胺(OPDA)結(jié)合生成熒光產(chǎn)物，通過(guò)對(duì)該熒光產(chǎn)物的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)維生素C的定量分析[10]。進(jìn)一步，采用十六烷基三甲基溴化銨產(chǎn)生熒光協(xié)同增敏作用[11]。

1.3 儀器與試劑

F-2500熒光分光光度計(jì)；FA2004A電子分析天平。 PHS-3CT精密酸度計(jì)；乙酸鈉溶液(5 g/L，25 g/L，100 g/L)；活性碳；鄰苯二胺溶液(2 g/L)；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液(6.0×10-4g/mL)；偏磷酸-冰醋酸-硫酸溶液：稱(chēng)取15g偏磷酸，加入40 mL冰醋酸，用0.015 mol/L 硫酸稀釋至500 mL；硼酸-乙酸鈉溶液：稱(chēng)取硼酸9 g，加入35 mL乙酸鈉溶液，用水稀釋至1 000 mL(使用前配制)；抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.500 g抗壞血酸溶于偏磷酸-冰醋酸溶液中，定容至500 mL容量瓶中，此標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為每毫升相當(dāng)于1 mg的抗壞血酸(新鮮配制)；吸取上述溶液5 mL，再用偏磷酸-冰醋酸溶液定容至50 mL，此溶液每毫升相當(dāng)于0.1 mg的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(新鮮配制)；維生素C樣品：果珍或橙汁；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)試

將制備好的50 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(含抗壞血酸0.1 mg/mL)倒入燒杯中，加1～2 g活性炭搖勻1 min，過(guò)濾。取50 mL容量瓶1只，準(zhǔn)確移取剛處理過(guò)的溶液1.0 mL，再加入20 mL硼酸-乙酸鈉溶液，用水定容至刻度，得到0.002 mg/mL 抗壞血酸/乙酸鈉溶液，此液作為標(biāo)準(zhǔn)空白溶液，測(cè)定熒光強(qiáng)度作為試劑空白(F0)。再取10 mL帶刻度的試管，吸取0.5 mL 上述溶液，用蒸餾水定容至3.0 mL；在避光的環(huán)境中，迅速向各管中加入5 mL鄰苯二胺溶液，2.0 mL 十六烷基三甲基溴化銨溶液, 加塞，振搖1～2 min，在室溫下，于暗處放置35 min，測(cè)量熒光強(qiáng)度F(激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)433 nm)。最終的熒光強(qiáng)度為計(jì)算ΔF=F-F0。

1.4.2 樣品的測(cè)試

(1) 測(cè)試條件的確定。 實(shí)驗(yàn)中選用乙酸鈉溶液為pH緩沖體系與氧化劑、CTAB為增敏劑、鄰苯二胺為輔助劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并采用模擬科研最佳條件的確定—正交實(shí)驗(yàn)的方法確定各種物質(zhì)的最佳用量：以乙酸鈉溶液的濃度(A)、CTAB用量(B)、鄰苯二胺用量(C)以及反應(yīng)溫度為考察因素(見(jiàn)表1)，以產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度為考察指標(biāo)，即采用4 個(gè)因素3 個(gè)水平的正交實(shí)驗(yàn)表L9(34)(見(jiàn)表2)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)問(wèn)題進(jìn)行討論，實(shí)驗(yàn)后將結(jié)果匯總，進(jìn)行正交分析，以確定各種物質(zhì)的最佳用量[12-15]。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

[注]:A為乙酸鈉溶液的濃度(g/L), B CTAB用量(mL), C為鄰苯二胺用量(mL), D為反應(yīng)溫度(℃)

表2 正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析

Ki(i= 1,2,3) 為：水平i三次考察指標(biāo)(產(chǎn)物熒光強(qiáng)度) 之和的平均值；S為極差：由同一影響因素的K/3(K1/3、K2/3 、K3/3)中的最大值減去最小值。由極差分析可知， A 、B、C、D 四因素對(duì)產(chǎn)率影響順序，若為C > D > B > A，則表明鄰苯二胺用量的改變對(duì)產(chǎn)物的熒光的影響作用最大。同時(shí)，依據(jù)表中數(shù)據(jù)，產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的條件，即為四種物質(zhì)的最佳用量。

(2) 工作曲線、線性范圍、檢出限。分別移取0.5、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0、2.5、3.0 mL 按1)維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)試方法中得到的0.002 mg/mL 抗壞血酸/乙酸鈉溶液，置于10 mL 帶刻度的試管中，并稀釋至3.0 mL得到系列維生素C標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，以熒光強(qiáng)度F對(duì)維生素C的濃度c(μg/mL)進(jìn)行線性回歸，確定維生素C在什么濃度范圍內(nèi)(例如濃度在0. 02～8.0 μg/mL范圍內(nèi))，與熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，采用Origin軟件求出其線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)。條件容許還可繼續(xù)測(cè)定其檢出限，以確定其靈敏度。

(3) 精密度試驗(yàn)。對(duì)5.0×10-4g/mL的維生素C標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測(cè)定7次，求出其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，確定其精密度。

(4) 樣品測(cè)定。稱(chēng)取均勻樣品10 g，用偏磷酸-冰醋酸溶液定容至100 mL，定容后過(guò)濾；將全部濾液轉(zhuǎn)入燒杯中加入1～2 g活性炭振搖1～2 min，過(guò)濾。取2只50 mL容量瓶，各加入5.0 mL經(jīng)氧化處理的樣液，并依據(jù)正交設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果添加一定量的CTAB溶液，再向其中一只加入20 mL 乙酸鈉溶液，用水稀釋至50 mL作為樣品溶液；另一只加入20 mL硼酸-乙酸鈉溶液，用水稀釋至刻度，作為樣品空白溶液。再取2支帶塞的刻度試管，1支試管中加2.0 mL樣品溶液為樣液，另一根試管中加入2.0 mL樣品空白溶液作為空白，再分別用蒸餾水定容至3.0 mL。在室溫下，在避光的環(huán)境中，迅速向各管中加入5 mL鄰苯二胺溶液，加塞，振搖1～2 min，于暗處放置35 min。最佳發(fā)射波長(zhǎng)條件下，測(cè)量熒光強(qiáng)度F，同時(shí)測(cè)定樣品空白溶液熒光強(qiáng)度F0，并計(jì)算得出實(shí)際熒光強(qiáng)度ΔF=F-F0。

最后，依據(jù)維生素C的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定果珍中維生素C含量。

1.5 分析過(guò)程中的注意點(diǎn)

(1) 標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液必須現(xiàn)用現(xiàn)配。

(2) 活性炭處理樣品前，一定要先進(jìn)行活化處理。

(3) 熒光測(cè)試過(guò)程中，多次測(cè)定，取平均值。

(4) 在處理各種樣品時(shí), 如遇到泡沫產(chǎn)生, 可以加入數(shù)滴辛醇消除。

1.6 實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果評(píng)價(jià)

在教學(xué)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們以新世紀(jì)創(chuàng)新型人才的培養(yǎng)為目標(biāo)，依據(jù)《普通高等學(xué)校本科教學(xué)工作水平評(píng)估方案》的導(dǎo)向要求，在傳統(tǒng)的評(píng)價(jià)體系的基礎(chǔ)上，引入多元智能理論，奉行多元化、情境化、發(fā)展性以及量化評(píng)價(jià)和質(zhì)性評(píng)價(jià)相結(jié)合原則，采用口試、過(guò)程檢測(cè)與檔案袋評(píng)價(jià)相結(jié)合的方式對(duì)學(xué)生的各種實(shí)驗(yàn)技能、實(shí)驗(yàn)思維等作比較全面的評(píng)價(jià)。在近兩年的實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)效果評(píng)價(jià)的結(jié)果是20%左右優(yōu)秀，15% 的操作不理想，其余為中等水平; 學(xué)生普遍反映該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有助于理解熒光法的實(shí)驗(yàn)原理，定性定量方法，以及正交實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)設(shè)計(jì)與分析條件的優(yōu)化。

2 結(jié) 語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)時(shí)，每人測(cè)定1 份果珍樣品，使每位學(xué)生獨(dú)立地完成樣品前處理、定性、定量分析所要求的分析測(cè)試操作，且每份果珍樣品的質(zhì)量各不相同，防止有人“跟幫坐車(chē)”或抄襲實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。對(duì)實(shí)驗(yàn)成績(jī)的考核，重點(diǎn)放在對(duì)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的解釋、對(duì)老師所提問(wèn)題和思考題的回答以及動(dòng)手操作上; 這些基本上能反應(yīng)學(xué)生分析問(wèn)題、解決問(wèn)題和動(dòng)手能力的強(qiáng)弱。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)既有利于啟迪學(xué)生的創(chuàng)新、設(shè)計(jì)思維，又有利于培養(yǎng)學(xué)生實(shí)踐、實(shí)際操作、創(chuàng)造、創(chuàng)業(yè)的能力以及強(qiáng)烈的責(zé)任心。

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Experimental Design and Teaching of Determination of Vitamin C by Fluorescence Spectrophotometry

HUANGFang-zhi，SHENYu-hua,LIShi-kuo,XIEAn-jian

(School of Chemistry & Chemical Engineering, Anhui University， Hefei 230039， China)

A high-quality experimental chemistry course (Determination of vitamin C by fluorescence spectrophotometry) was designed and renewed through the reform practice of experimental teaching. In the experimental teaching, it was proved to be of value in training students' comprehensive and practical ability and in enlightening students' creative thoughts in their research activities. During the experiment process, students not only learn the method of orthogonal design and sample preparation, but also better understand and master the analysis principles, operation methods, qualitative and quantitative methods, and importance of fluorescence spectrophotometry in the analysis of natural compounds. A couple of years' running demonstrates that the high-quality experimental chemistry course is effective.

fluorescence spectrophotometry; chemical comprehensive experiment; experimental teaching; creative thinking

2014-09-15

國(guó)家自然科學(xué)基金(50973001);安徽大學(xué)教育教學(xué)改革研究項(xiàng)目(JYXM201331)；安徽大學(xué)精品實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(SY201202)

黃方志(1978-)，男，安徽懷寧人，副教授，碩士生導(dǎo)師，基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)中心副主任，研究方向:功能材料的制備與應(yīng)用研究。

Tel.:0551-63861327; E-mail:huangfangzhi@163.com

G 642.423

A

1006-7167(2015)05-0097-03