李智寧　李湄川　胡德禹　等

摘要：為確保殺菌劑噻森銅在煙草上的安全使用，建立了一種高效液相色譜（HPLC-DAD）測定煙草中噻森銅殘留量的分析方法。煙葉樣品經(jīng)硫代硫酸鈉溶液衍生和提取，離心，三氯乙烯凈化，乙酸乙酯萃取，高效液相色譜檢測。結(jié)果表明，方法的平均回收率為79.55%～98.16%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.94%～7.55%，噻森銅最低檢出限為1.8 ng，噻森銅在煙葉樣品中的最低檢測限為0.5 mg/kg，符合農(nóng)藥殘留分析的要求，適合煙草基質(zhì)中噻森銅殘留量的準(zhǔn)確檢測。

關(guān)鍵詞：噻森銅；高效液相色譜；煙草

中圖分類號(hào)： O657.7+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0284-03

收稿日期：2014-03-07

基金項(xiàng)目：貴州省重大科技專項(xiàng)（編號(hào)：20136024）；貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：20083053）。

作者簡介：李智寧（1987—），男，河南開封人，碩士研究生，從事農(nóng)藥殘留分析與環(huán)境毒理研究。E-mail：aning072@126.com。

通信作者：胡德禹，研究員，碩士生導(dǎo)師。Tel：（0851）8292170；E-mail：gzu_dyhu@126.com。噻森銅[N，N′-甲撐-雙（2-氨基-5-巰基-1，3，4-噻二唑）銅]是我國自主創(chuàng)制的噻二唑類有機(jī)銅殺菌劑，是農(nóng)業(yè)部全國農(nóng)技中心重點(diǎn)推薦農(nóng)藥品種之一。其結(jié)構(gòu)式見圖1。其熔點(diǎn)300 ℃（分解），20 ℃時(shí)不溶于水，不溶于一般的有機(jī)溶劑，只微溶于吡啶、二甲基甲酰胺，遇強(qiáng)堿分解，在酸性條件下穩(wěn)定。由于其結(jié)構(gòu)由噻唑基與銅離子2 個(gè)基本基團(tuán)組成，故有著特殊的作用機(jī)制 [1]。因此，噻森銅防治作物細(xì)菌性病害和真菌性病害具有高效廣譜，低毒安全、環(huán)保無公害，不易產(chǎn)生抗性及持效期長等優(yōu)點(diǎn)[2]

目前國內(nèi)外對噻森銅的研究主要集中在田間藥效[3-4]及殺菌活性[5]，對其殘留分析的研究未見報(bào)道，為此查閱了一些與其結(jié)構(gòu)相似的噻二唑類殺菌劑（噻菌銅/噻枯唑[6-11]）的殘留分析方法，如采用硫化鈉溶液水解，XAD-7樹脂富集提取，柱層析純化，液相色譜檢測[6-7]；硫化鈉溶液和甲醇提取，乙酸乙酯凈化，液相色譜檢測[8-9]；乙酸乙酯和二甲基甲酰胺混合液振蕩提取，離心凈化，液相色譜檢測[11]。采用硫化鈉衍生易產(chǎn)生對環(huán)境危害的副產(chǎn)物，且柱層析凈化耗時(shí)較長，成本較高。鑒于此，建立新穎的，對環(huán)境友好的噻森銅殘留檢測方法十分必要。故本研究擬建立高效液相色譜法檢測噻森銅在煙草中的殘留，旨在為噻森銅在煙草上及其他農(nóng)作物上安全使用提供參考。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

1.1.1主要儀器Agilent 1100 高效液相色譜儀（配DAD檢測器）；渦旋混合儀（QL-901，其林貝爾儀器制造公司生產(chǎn)）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000/2000A，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)）；氮吹儀（N-EVAPTM，上海安譜科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）；水浴恒溫振蕩器（SHZ-A，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)）；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-Ⅲ，鄭州長城科工貿(mào)易有限公司生產(chǎn)）。

1.1.2試劑甲醇（分析純、色譜純），乙腈（色譜純），乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、冰乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、硫代硫酸鈉、碳酸鉀和硫化鈉均為分析純；超純水，硅藻土Celite545，無水硫酸鈉（450 ℃ 烘烤4 h，于干燥器中保存）；噻森銅標(biāo)準(zhǔn)品（純度95.6%，浙江東風(fēng)化工有限公司提供）；2-氨基-5-硫基-1，3，4-噻二唑（AMT）標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.0%，購于北京百靈威有限公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1樣品的提取和凈化衍生和提?。悍Q取10.0 g煙葉樣品置于150 mL錐形瓶中，然后加入50 mL 0.5 mol/L硫代硫酸鈉溶液，在60 ℃ 恒溫水浴中，衍生反應(yīng)振蕩提取2 h，取出冷卻至室溫，準(zhǔn)確量取40 mL提取液于50 mL離心管中，待凈化。

凈化：在上述離心管中加入6 g NaCl，以及2.0 mol/L NaOH使得溶液pH至12～13，待絮狀物雜質(zhì)析出，并于 6 000 r/min 離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)入125 mL分液漏斗中，再用40 mL含2%乙醇的三氯乙烯溶液預(yù)萃取1次，棄去下層有機(jī)相，上層用1.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3～4，用50、40 mL 乙酸乙酯萃取2次，合并有機(jī)相，過無水硫酸鈉，濃縮至近干，N2吹干，甲醇定容至1 mL，過0.45 μm濾膜，待HPLC檢測。

1.2.2色譜檢測條件分別對色譜柱A：Eclipse XDB-C18，ZORBAX SB-C18，Phenomenex kinetex XB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm） 和色譜柱B：Phenomenex C18/NH2，Lichrospher C18/CN/C8 （250 mm×4.6 mm，5 μm ）進(jìn)行篩選，同時(shí)改變流動(dòng)相乙腈與0.1%乙酸水的體積比，確定最佳流動(dòng)相。

2結(jié)果與分析

2.1色譜條件的選擇

2.1.1檢測波長的選擇采用DAD檢測器對噻森銅衍生化產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)溶液（AMT，125 μg/mL）進(jìn)行全波長掃描（掃描范圍210～400 nm），從而得到AMT的吸收波長和響應(yīng)值之間的紫外吸收光譜圖（圖2），可見AMT的最大吸收峰出現(xiàn)在312～314 nm處。因此，確定AMT的最佳檢測波長是313 nm。

2.1.2色譜柱的選擇由圖3可知，色譜柱A色譜柱短，響應(yīng)值較大，出峰時(shí)間早，分析時(shí)間快，但是煙草基質(zhì)復(fù)雜，會(huì)有雜質(zhì)影響。圖4顯示，色譜柱B（Phenomenex C18 色譜柱）響應(yīng)值較大，出峰時(shí)間合適，峰形尖銳，對稱性好，與雜質(zhì)峰分離效果較好。故本研究最終選擇 Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm ） 色譜柱。endprint

2.1.3流動(dòng)相的選擇AMT分子巰基上的質(zhì)子可以電離，并測得其電離常數(shù)Ka=1.8×10-7，其溶液呈微酸性[12-13]；在水中的溶解度較小，但隨溫度的增加而增加，AMT水溶液的pH=3.9，AMT乙醇溶液的pH=4.6[14]；故本研究選擇乙腈與乙酸水溶液作為流動(dòng)相的組成溶劑，使流動(dòng)相呈現(xiàn)一定的酸性，在實(shí)驗(yàn)中多次改變乙腈與乙酸水溶液的比例，最終確定了流動(dòng)相為乙腈-0.1%乙酸水（17.5 ∶82.5，體積比），此時(shí)獲得的峰形較好。

2.2噻森銅標(biāo)準(zhǔn)曲線

用電子天平稱取0.026 1 g 噻森銅標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中配制為250 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液備用。將250 mg/L的噻森銅標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液用甲醇稀釋配得1.0、2.5、5.0、10.0、

25.0、50.0 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.2.2”節(jié)中樣品前處理步驟進(jìn)行噻森銅標(biāo)樣衍生化，每個(gè)濃度重復(fù)3次，以噻森銅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（x）與色譜峰面積（y）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度在2.5～50 mg/L線性范圍內(nèi)，線性方程為：y=31.812 0x-35.122 0，相關(guān)系數(shù)（r）=0.999 8。

2.3方法的準(zhǔn)確度與精密度

取空白煙葉樣品，添加不同濃度噻森銅標(biāo)樣，每個(gè)濃度設(shè)5次重復(fù)，按照“1.2.2”節(jié)的測定步驟進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，另設(shè)空白對照。測定結(jié)果見表1，結(jié)果表明噻森銅在煙葉樣品添加水平為0.5～50.0 mg/kg時(shí)，回收率分別為75.92%～107.40%，RSD為0.94%～7.55%。試驗(yàn)結(jié)果均符合農(nóng)藥殘留分析要求。表1噻森銅在煙葉中的添加回收率（n=5）

噻森銅添加水平

（mg/kg）添加回收率（%）ⅠⅡⅢⅣⅤ平均RSD

（%）0.575.9280.5088.0784.8587.6183.396.172.578.8880.4080.0078.6779.8479.550.945.099.3296.98107.4093.5993.5198.165.8250.085.32102.9089.1790.8387.8091.227.55

2.4最低檢出限和最低檢測限

在建立的色譜分析條件下，外標(biāo)法定量，以3 倍信噪比（S/N=3）確定儀器的最低檢出限，結(jié)果表明，本研究建立的檢測方法，噻森銅的最低檢出限為1.8 ng。噻森銅在煙草樣品中的最低檢測限為0.5 mg/kg。煙葉空白樣品（CK）、添加樣品（TJ）和標(biāo)準(zhǔn)樣品（BY）譜圖如圖5所示。

3結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用高效液相色譜和紫外檢測器建立的煙草中噻森銅殘留分析方法，噻森銅最低檢出限為1.8 ng，噻森銅在煙草樣品中的最低檢測限為0.5 mg/kg，滿足國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的檢測要求，同時(shí)該方法經(jīng)濟(jì)、安全，有機(jī)溶劑用量較小，操作簡單，雜質(zhì)干擾較少，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，能保證檢測分析數(shù)據(jù)的可靠性。

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