謝坐祥，陳 霞，張俊鵬

（大理大學(xué)工程學(xué)院，云南大理 671003）

乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）是一類引起人類慢、急性肝炎的環(huán)狀DNA病毒〔1〕。目前全球約有2.4億人感染乙型肝炎，每年約有78萬人死于慢性或急性乙型肝炎。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）〔1〕報(bào)告，我國(guó)有5%～10%的成年人是HBV慢性感染者。

HBV基因?yàn)椴糠珠]合雙鏈環(huán)狀DNA，全長(zhǎng)約3.2 kb。它主要分為P、X、C和S 4個(gè)基因區(qū)，C區(qū)分為C基因和前C基因片段，S區(qū)分為前S1、前S2和S基因片段〔2〕。目前研究表明：HBV基因型可以分為A、B、C、D、E、F、G和H 8種類型，不同的基因型呈現(xiàn)不同地理區(qū)域分布，我國(guó)主要以B和C兩種基因型為主〔3〕。

本文將基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法和數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)實(shí)現(xiàn)HBV多序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化分析和特征提取3個(gè)層次的分析。這將有利于進(jìn)一步了解HBV病毒在序列層次下的進(jìn)化關(guān)系、突變過程、基因特點(diǎn)和基因型種類，進(jìn)而為HBV患者提供更科學(xué)有效的輔助治療。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)源 本文選用的HBV序列數(shù)據(jù)源來源于云南省第一人民醫(yī)院〔3〕，選取的HBV序列片段為X和前C基因片段。10例HBV感染者樣本使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴(kuò)增技術(shù)克隆至364個(gè)樣本，每例樣本的克隆數(shù)如表1所示。

表1 HBV感染者樣本及其克隆數(shù)

1.2 分析方法 HBV序列分析流程圖如圖1所示，整個(gè)分析過程由3個(gè)步驟組成。步驟1獲取HBV數(shù)據(jù)源，數(shù)據(jù)源包括364個(gè)HBV樣本序列和38個(gè)HBV參考序列，然后進(jìn)行多序列比對(duì)。為了保證HBV多序列比對(duì)的質(zhì)量，本文采用手動(dòng)比對(duì)方法對(duì)HBV序列進(jìn)行多序列比對(duì)。步驟2就比對(duì)后的HBV序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，通過構(gòu)造系統(tǒng)進(jìn)化樹建立HBV樣本序列與參考序列之間的進(jìn)化分析。本文使用鄰接法〔4〕、最大似然法〔5〕、最小進(jìn)化法〔6〕、平均距離法〔7〕和最大簡(jiǎn)約法〔8〕5種常用方法分別對(duì)10例HBV克隆序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；為了研究堿基位點(diǎn)與HBeAg陽性與陰性的關(guān)系，步驟3對(duì)364個(gè)HBV樣本序列進(jìn)行特征堿基位點(diǎn)提取，提取方法采用CFS（Correlation Feature Selection）〔9〕、卡方檢驗(yàn)（Chi-square Test）〔10〕和信息熵（Information Entropy）〔11〕3種方法進(jìn)行特征提取。為了評(píng)價(jià)特征提取前后的分類精度，分別使用決策樹C4.5算法〔12〕、樸素貝葉斯（Nave Bayes）〔13〕、支持向量機(jī)（SVM）〔14〕和隨機(jī)森林（Random Forest）〔15〕4種分類器對(duì)HBV序列樣本進(jìn)行分類精度比較。

圖1 HBV序列分析流程圖

2 HBV序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

進(jìn)化分析是從分子特性出發(fā)了解生物系統(tǒng)的內(nèi)在規(guī)律。進(jìn)化論表明物種之間存在一定的親緣關(guān)系，一般用系統(tǒng)進(jìn)化樹距離的大小表示序列進(jìn)化中親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

本文使用MEGA v6軟件中的鄰接法、最大似然法、最小進(jìn)化法、平均距離法和最大簡(jiǎn)約法5種方法對(duì)10例HBV克隆序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，參數(shù)為MEGA軟件默認(rèn)設(shè)置參數(shù)。通過分析系統(tǒng)進(jìn)化樹，5種方法所預(yù)測(cè)的HBV基因型完全一致，這也驗(yàn)證了不同方法預(yù)測(cè)HBV基因型結(jié)果一致性。

除了編號(hào)8、13和24的真實(shí)基因型未知外，其余編號(hào)的預(yù)測(cè)基因型與真實(shí)基因型結(jié)果完全一致，見表1。這也進(jìn)一步說明采用系統(tǒng)進(jìn)化樹預(yù)測(cè)未知HBV序列基因型的方法是有效的。

3 HBV序列特征提取

特征提取也叫特征選擇，它是數(shù)據(jù)預(yù)處理的關(guān)鍵步驟。其主要思想是從已知的特征屬性集中根據(jù)某一特定準(zhǔn)則提取出區(qū)分性較好的單個(gè)特征子集或一個(gè)最優(yōu)特征屬性子集〔16〕。經(jīng)特征提取后可以剔除大量的冗余信息和不相關(guān)特征信息，這不僅降低特征屬性空間維數(shù)，還節(jié)約分析時(shí)間和提高對(duì)目標(biāo)函數(shù)的預(yù)測(cè)性能力。

目前研究表明，每條HBV序列的堿基位點(diǎn)中，往往很多堿基位點(diǎn)是保守的，與HBV基因型分類無關(guān)，因此對(duì)HBV序列的堿基位點(diǎn)進(jìn)行特征提取可以提高HBV基因型正確率和預(yù)測(cè)水平，同時(shí)在序列層次下挖掘與乙型肝炎患者相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（Single-Nucleotide Polymorphism，SNP）〔17〕。

3.1 特征堿基位點(diǎn)提取 HBV序列經(jīng)過多序列比對(duì)后，總共有624個(gè)堿基位點(diǎn)。由于CFS方法提取的是一個(gè)最優(yōu)屬性集，其大小為11。然而，卡方和信息熵方法按照權(quán)重重要性排列每個(gè)堿基位點(diǎn)，其大小為624。為了公平地比較他們之間的分類精度，卡方和信息熵方法都統(tǒng)一選擇前11個(gè)最具有代表性的特征屬性集。

另一方面，為了研究屬性集大小與分類精度之間的關(guān)系，將卡方和信息熵方法提取的特征屬性集大小擴(kuò)大至20、30、40和50。

3.2 分類結(jié)果分析 本文選取決策樹C4.5、Na?ve Bayes、SVM和Random Forest 4種經(jīng)典分類器對(duì)CFS、卡方和信息熵3種特征提取前后的HBV序列進(jìn)行分類分析。軟件平臺(tái)為WEKA v3.7，屬性集大小設(shè)置為11，20、30、40和50。

如表2所示，Original代表原始HBV序列數(shù)據(jù)，CFS-11代表CFS特征提取方法后的HBV序列數(shù)據(jù)，Chi-11、Chi-20、Chi-30、Chi-40和Chi-50分別代表卡方特征提取法的前11、20、30、40和50特征屬性集大小的HBV序列數(shù)據(jù)，InfoGain-11、InfoGain-20、InfoGain-30、InfoGain-40和InfoGain-50分別代表信息熵特征提取法的前11、20、30、40和50特征屬性集大小的HBV序列數(shù)據(jù)。當(dāng)特征屬性集大小為11的時(shí)候，4種分類器的分類精度ACC（Accuracy）有所降低，但是所選擇的11個(gè)特征屬性集也能夠很好的表征出原始HBV序列數(shù)據(jù)的624個(gè)特征屬性。隨著特征屬性集大小的增大，4種分類器的分類精度ACC都有增大的趨勢(shì)。特別地，當(dāng)特征屬性集大小選擇合適時(shí)，Na?ve Bayes和Random Forest的分類精度ACC可以達(dá)到最大值1。這些結(jié)果表明：特征提取對(duì)HBV序列數(shù)據(jù)降維的同時(shí)，也能夠保證甚至提高分類精度ACC。

表2 比較不同特征提取方法的分類精度ACC

4 結(jié)語

本文從多序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化分析和特征提取3個(gè)層次對(duì)10例HBV感染者的HBV序列進(jìn)行分析。首先采用手動(dòng)比對(duì)方法對(duì)HBV序列進(jìn)行多序列比對(duì)。然后利用鄰接法、最大似然法、最小進(jìn)化法、平均距離法和最大簡(jiǎn)約法構(gòu)造10例HBV克隆序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。5種系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)造法的預(yù)測(cè)結(jié)果完全一致，預(yù)測(cè)的10例（編號(hào)8、10、13、17、24、26、32、213、264和320）HBV感染者基因型分別為：C、C、C、Ba、C、C、C、C、C和C。除去未知基因型，準(zhǔn)確率為100%。為了降低HBV序列數(shù)據(jù)的維數(shù)，采用CFS、卡方檢驗(yàn)和信息熵3種方法進(jìn)行特征提取。4種分類器（決策樹C4.5、Na?ve Bayes、SVM和Random Forest）的分類結(jié)果表明：特征提取能夠降低HBV序列數(shù)據(jù)的維數(shù)，同時(shí)保證甚至提高分類精度。

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