劉文捷，郭曲練，何萬友，彭良玉

（1.南華大學附屬第一醫(yī)院 麻醉科，湖南 衡陽421001；2.中南大學湘雅醫(yī)院 麻醉科，湖南 長沙410008；3.廣東省佛山市第一人民醫(yī)院 麻醉科，廣東 佛山528000）

隨著糖尿病發(fā)病人數(shù)的逐年增加[1-3]，痛性糖尿病神經(jīng)病變（painful diabetic neuropathy，PDN）作為糖尿病最常見的并發(fā)癥，成為危害公眾身體健康及生活質(zhì)量最嚴重的問題之一[4-5]。PDN常表現(xiàn)為痛覺敏化、異常痛和自發(fā)痛，其中痛覺敏化是PDN的主要病理機制。痛覺敏化的形成涉及多種細胞因子、遞質(zhì)、受體、離子通道和核內(nèi)第三信使的表達，是感覺神經(jīng)元到脊髓神經(jīng)元突觸敏感性和興奮性增強的過程。細胞內(nèi)外鈣離子濃度的動態(tài)平衡是神經(jīng)元細胞保持正常興奮性的有力保證之一。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病可以通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子含量，破壞感覺神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子穩(wěn)態(tài)，從而干擾神經(jīng)元鈣離子信號的形成、放大、傳播和終止。

鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)蛋白1（calcium homeostasis modulator 1，CALHM1）作為存在于神經(jīng)元細胞膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的新型鈣離子通道，受膜電壓及細胞外鈣離子濃度的雙重調(diào)控[6]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞外鈣離子濃度降低能激活CALHM1，其被激活后會增加細胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的通透性；同時還通過降低鈣離子的轉運能力和肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子—ATP酶（sarco/endoplasmic calcium transporting AT-Pase，SERCA）對鈣的親和力，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對鈣離子的再攝取[7]，導致細胞內(nèi)鈣離子濃度急劇升高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離子含量急劇減少，細胞內(nèi)外鈣離子的穩(wěn)態(tài)被破壞，從而誘發(fā)細胞興奮性增高和未折疊蛋白反應的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。因此，筆者假設CALHM1被激活后出現(xiàn)的細胞內(nèi)外鈣離子濃度失衡很可能是PDN發(fā)生的重要原因之一。本實驗主要研究CALHM1在PDN大鼠模型脊髓背角神經(jīng)元上的表達，為更好地治療PDN提供一個可能的治療靶點和新思路。

1 材料與方法

60只健康雄性2月齡Sprague-Dawley大鼠，體重180～200 g，采用隨機分組方法（隨機數(shù)字表法）將實驗動物分為對照組（C組）和模型組（D組），每組30只。C組腹腔注射生理鹽水1.2ml，D組腹腔注射1%鏈尿佐菌素（streptozotocine，STZ）60mg/kg。建模后48 h血糖>16.7mmol/L視為建模成功。分別于建模前及建模后1、2、3、4、5和6周，采用Von Frey絲測定大鼠縮足反應閾值（paw withdraw threshold，PWT）。

1.1 標本制備

1.1.1 免疫組織化學標本制備 建模成功后第6周，將兩組各10只實驗大鼠予以10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉后，剖開胸腔經(jīng)心臟插管，以4℃的4%多聚甲醛300～400ml灌注固定后，取出腰段膨大處脊髓組織，置于4%多聚甲醛固定液，梯度酒精脫水，二甲苯進行透明處理，石蠟制成蠟塊，切片備用。

1.1.2 W estern blot和實時熒光定量核酸擴增反應（qRT-PCR）檢測標本制備 建模成功后第6周，將兩組各20只實驗大鼠予以10%水合氯醛400mg/kg腹腔注射麻醉后，放置在冰上迅速解剖分離腰脊髓膨大，置于防凍EP管中，于液氮中保存待用。

1.2 免疫組織化學

將免疫組織化學標本的蠟塊切片至5μm，在恒溫水浴箱將切片平整展開，攤片至玻片，并置于37℃烤箱中烤片過夜。經(jīng)過2次100%二甲苯脫蠟后，按SP超敏二步法染色，抗CALHM1（ab106561）濃度為1∶100，干燥后用中性樹膠封片，最后在顯微鏡下拍片觀察各組脊髓背角CALHM1的表達。選取脊髓背角（I、Ⅱ板層）計算陽性細胞率，陽性細胞率（%）=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.3 Western blot檢測

將兩組各10只實驗大鼠的標本自液氮罐中取出，并研磨組織至單細胞狀態(tài)，每10 mg組織加入200μl裂解液（含PMSF），冰上裂解30 min；4℃、12 000 r/min離心15min，將上清分裝于EP管中，考馬斯亮藍G250測定蛋白質(zhì)溶液的OD值，調(diào)整樣品的蛋白濃度。采用不連續(xù)系統(tǒng)蛋白質(zhì)SDS-PAGE，濃度為12%的分離膠，總蛋白上樣量40～60μg/孔，Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置及PVDF膜，轉膜恒壓70V，根據(jù)目的蛋白分子量選擇40min，然后立即洗去膜上的轉膜液，加入5%脫脂奶粉封閉液。1∶500（CALHM1）稀釋一抗。將PVDF膜放入含一抗溶液中，4℃孵育一抗過夜，然后按照1∶5 000稀釋辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標記的二抗。將PVDF膜加入稀釋好的二抗。使用Beyo ECL Plus化學發(fā)光試劑，黑暗處顯色，用X光片壓片，顯影液及定影液洗片。Band Scan圖像分析系統(tǒng)對區(qū)帶進行掃描分析。

1.4 實時熒光定量核酸擴增檢測

將兩組各10只實驗大鼠的標本自液氮罐中取出，在培養(yǎng)板中加入裂解液MZ裂解細胞，2 100 r/min（400×g）離心5min取細胞，棄上清液。加入1m l裂解液MZ，使核酸蛋白復合物完全分離，然后再4℃、12 000 r/min（13 400×g）離心5min，取上清液，加入200μl氯仿，室溫放置5min。再4℃、12 000 r/min（13 400×g）離心15 min，樣品分3層：黃色的有機相、中間層和無色的水相。RNA主要在水相中，水相的體積約為所用裂解液MZ試劑的50%。把水相轉移到新管中，緩慢加入轉移液體積0.43倍的無水乙醇，混勻（此時可能會出現(xiàn)沉淀）。將得到的溶液和沉淀一起轉入吸附柱miRspin，室溫12 000 r/min（13 400×g）離心30 s，若一次不能將全部溶液和沉淀加入吸附柱miRspin，就分二次轉入，離心后棄掉吸附柱miRspin，保留流出液。緩慢加入流出液體積0.75倍的無水乙醇，混勻轉入吸附柱miRelute，室溫12 000 r/min（13 400×g）離心30 s，保留吸附柱miRelute。加入500μl去蛋白液MRD，室溫靜置2 min，室溫12 000 r/min（13 400×g）離心30 s，棄廢液。向吸附柱miRelute加入600μl漂洗液RW，室溫靜置2min，室溫12 000 r/min（13 400×g）離心30 s，棄廢液。將吸附柱miRelute轉入一個新的RNase-Free 1.5m l離心管中，加15～30μl RNase-Free ddH2O，室溫放置2min，室溫12 000 r/min（13 400×g）離心2min。逆轉錄步驟按照TaKaRa Prime ScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit（D6210A）試劑盒說明書進行操作，根據(jù)目的基因的種屬及名稱，在NCBI數(shù)據(jù)庫查詢參考核苷酸序列，采用Primer 3.0設計熒光定量PCR引物，引物序列經(jīng)NCBI nBlast比對無非特異性擴增，用于qRT-PCR實驗。Real Time PCR的擴增曲線和熔解曲線采用Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR System的操作方法。運用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀配套的Bio-Rad CFX Manager Software 1.6分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，且采用2-ΔΔCt法計算。實驗目的基因引物序列（5'-3'）見表1。

表1 實驗目的基因引物序列（5'-3'）

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較用非獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較用完全隨機設計的ANOVA，相關性分析用Pearson檢驗；所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組動物建模前后體重及血糖比較

兩組大鼠在腹腔注射STZ前及注射后第1、2、3、4和5周進行體重測量。建模前和建模后第1周兩組體重比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；建模后第2、3、4和5周測量體重C組大鼠體重上升幅度大于D組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見

表2 兩組動物建模前后體重比較 （g，±s）

表2 兩組動物建模前后體重比較 （g，±s）

組別 建模前 建模后1周 建模后2周 建模后3周 建模后4周 建模后5周C組 211.73±14.92 239.20±14.12 281.86±10.27 339.24±12.48 377.13±16.34 425.11±11.78 D組 212.21±14.86 228.10±10.75 237.13±11.82 242.92±8.69 256.97±13.63 268.83±7.82 P值 0.768 0.142 0.004 0.000 0.000 0.000

2.2 兩組動物建模前后血糖比較

2.3 各組大鼠行為學測試

比較兩組實驗大鼠在機械痛刺激下50%PWT的變化，建模前及建模后第1周兩組大鼠的50%PWT比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），從建模后第2周開始至第6周，D組大鼠的50%PWT均顯著低于C組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表4。

2.4 各組脊髓背角免疫組織化學檢測

兩組大鼠在建模前及建模成功后第1、2、3、4和5周抽尾靜脈血檢測空腹血糖。兩組大鼠建模前空腹血糖比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；D組建模后第1、2、3、4和5周的空腹血糖均明顯高于同時間的C組（P<0.01）。見表3。

表3 兩組大鼠建模前后空腹血糖比較 （mmol/L，±s）

表3 兩組大鼠建模前后空腹血糖比較 （mmol/L，±s）

組別 建模前 建模后1周 建模后2周 建模后3周 建模后4周 建模后5周C組 5.11±0.63 5.24±0.42 5.23±0.71 5.34±0.41 5.02±0.53 5.07±0.58 D組 5.04±0.51 19.79±1.08 22.27±1.09 25.32±0.93 27.68±1.26 28.52±1.03 P值 0.538 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 兩組大鼠建模前后50%PWT值比較 （g，±s）

表4 兩組大鼠建模前后50%PWT值比較 （g，±s）

組別 建模前 建模后1周 建模后2周 建模后3周 建模后4周 建模后5周 建模后6周C組 9.87±1.22 10.83±1.54 10.67±1.53 10.44±1.32 10.22±1.31 9.04±1.92 9.48±1.39 D組 10.31±1.64 9.61±0.92 7.61±1.24 5.31±0.96 3.79±0.58 3.71±0.62 3.61±0.43 P值 0.384 0.171 0.006 0.000 0.000 0.000 0.000

兩組大鼠在建模后第6周處死，進行脊髓背角免疫組織化學檢測。組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)CALHM1主要在脊髓背角處表達，而在脊髓其他部位表達較少；兩組間比較發(fā)現(xiàn)D組大鼠脊髓背角神經(jīng)元細胞膜及細胞質(zhì)中CALHM1的表達明顯多于C組，表現(xiàn)為CALHM1陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，染色較深。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對兩組所有圖片進行積分光密度（integral optical density，IOD）定量分析，發(fā)現(xiàn)兩組脊髓背角神經(jīng)元細胞CALHM1的表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。免疫組織化學法檢測CALHM1在兩組大鼠脊髓背角中的表達，C組大鼠脊髓背角中僅有少數(shù)神經(jīng)元CALHM1的表達為陽性（見圖1、2）；D組大鼠脊髓背角中CALHM1在大部分神經(jīng)元細胞膜及細胞質(zhì)中表達，并且呈強陽性（見圖3、4）。見表5。

圖1 C組大鼠脊髓背角免疫組織化學染色 （×100）

圖2 C組大鼠脊髓背角免疫組織化學染色 （×400）

圖3 D組大鼠脊髓背角免疫組織化學染色 （×100）

圖4 D組大鼠脊髓背角免疫組織化學染色 （×400）

表5 兩組大鼠脊髓背角免疫組織化學檢測比較

2.5 兩組大鼠脊髓組織Western blot檢測

兩組大鼠脊髓組織CALHM1的表達采用Western blot檢測。比較發(fā)現(xiàn)D 組大鼠脊髓CALHM1表達明顯高于C組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。Western blot檢測兩組大鼠脊髓中CALHM1的表達，C組大鼠脊髓中CALHM1的表達低于D組。將兩組大鼠脊髓中CALHM1表達的Western blot檢測結果進行灰度掃描，并進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)D組大鼠脊髓中CALHM1表達明顯高于C組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖5、6。

圖5 兩組大鼠脊髓CALHM 1蛋白表達的比較

2.6 兩組大鼠脊髓組織CALHM 1 m RNA實時熒光定量核酸擴增檢測

兩組大鼠脊髓組織CALHM1 mRNA采用qRTPCR檢測。比較發(fā)現(xiàn)D組大鼠脊髓CALHM1mRNA表達明顯高于C組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖7和表6。

圖6 兩組大鼠脊髓CALHM1表達的比較

圖7 兩組大鼠脊髓中CALHM 1 m RNA的表達

表6 兩組大鼠qRT-PCR Ct值及CALHM 1 m iRNA表達量分析表

2.7 大鼠脊髓CALHM 1 m RNA表達水平與50%縮足反應閾值的相關性分析

圖8 大鼠脊髓CALHM1 mRNA表達水平與50%PWT相關性分析

為驗證PDN敏感大鼠的CALHM1 mRNA表達水平是否與痛閾相關，本研究統(tǒng)計分析建模后6周D組大鼠脊髓CALHM1 mRNA表達水平與建模后第6周D組大鼠50%PWT的相關性。Pearson檢驗統(tǒng)計分析顯示，建模后6周D組大鼠脊髓CALHM1 mRNA表達水平與50%PWT呈負相關，危險系數(shù)為-0.859 4，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖8。

3 討論

2008年，MARAMBAUD的研究小組發(fā)現(xiàn)一個與阿爾茨海默病發(fā)病有關的新基因，即CALHM1基因，其表達產(chǎn)物CALHM1是一個多重跨膜糖蛋白[8]。CALHM1基因表達的糖基化蛋白主要表達于成人腦組織的神經(jīng)元或其他可興奮細胞的細胞膜或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，其他組織器官表達水平較低[9]。由于CALHM1在維持鈣穩(wěn)態(tài)和淀粉樣蛋白β 調(diào)節(jié)中具有重要功能，因此被視為可能在癲癇發(fā)作中具有重要功能的基因[10]。最新研究表明，CALHM1是電壓門控性、ATP親水性離子通道及甜、鮮、苦等Ⅱ型味覺細胞ATP釋放通道。CALHM1基因在所有味蕾Ⅱ型味覺細胞中表達[11]，其翻譯的蛋白與連接蛋白和通道蛋白的結構及功能相似[6]。CALHM1基因敲除后大鼠失去甜、鮮、苦味覺，并且伴有味覺神經(jīng)反應受損[12]。這一研究說明CALHM1并不只在大腦中表達，在其他可興奮細胞中也發(fā)揮作用。

PDN是糖尿病患者常見的并發(fā)癥，好發(fā)于四肢，是糖尿病患者對疼痛刺激或輕微、正常非疼痛刺激的過激反應。糖尿病患者的背根神經(jīng)節(jié)中疼痛感覺神經(jīng)元處于過度興奮狀態(tài)，導致PDN[13]。有研究顯示，Cav3.2 T型鈣及TRPV1通道參與PDN的發(fā)生[14]。氧化應激通過靶向TRP通道也參與PDN[15]，但具體機制尚不清楚。

細胞外鈣離子濃度在維持生理功能方面發(fā)揮重要作用，生理或病理條件下改變鈣離子濃度可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性。而CALHM1是構成調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性相關細胞外鈣離子濃度離子通道的一個重要亞基[7]。因此，本研究假設CALHM1參與PDN。

首先，本研究成功構建PDN大鼠模型，并檢測兩組大鼠的行為學變化，確認PDN模型構建成功，然后采用免疫組織化學法定位檢測大鼠脊髓背角CALHM1的表達。結果顯示，大鼠脊髓背角CALHM1表達陽性的神經(jīng)元顯著多于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；免疫組織化學結果顯示，除脊髓背角外，脊髓其他部分的CALHM1表達不明顯。因此，在利用Western blot定量檢測CALHM1蛋白質(zhì)表達以及利用qRT-PCR定量檢測CALHM1 mRNA表達時，并未再檢測脊髓背角，而是采用更簡便的方式直接檢測整個脊髓腰膨大部分的CALHM1表達。Western blot結果顯示，PDN大鼠脊髓腰膨大部分的CALHM1表達顯著高于對照組；qRT-PCR結果顯示，CALHM1大鼠脊髓腰膨大部分CALHM1mRNA表達顯著高于對照組。這說明PDN大鼠脊髓CALHM1表達顯著高于對照組。為進一步證實PDN大鼠脊髓背角CALHM1的表達上調(diào)與PDN大鼠行為學改變的關系，從而驗證CALHM1在脊髓的表達變化是否參與大鼠脊髓痛閾改變，本研究統(tǒng)計分析PDN大鼠建模6周后，脊髓腰膨大部分CALHM1 mRNA表達水平與50%PWT的相關性。結果顯示，兩者呈負相關，差異有統(tǒng)計學意義。說明PDN大鼠脊髓背角CALHM1表達越高，50%PWT越低。因此，筆者認為CALHM1的高表達與PDN相關，但其機制有待進一步研究。

綜上所述，PDN大鼠脊髓背角神經(jīng)元上CALHM1表達較正常對照組顯著增高；CALHM1與PDN發(fā)生相關，為CALHM1作為潛在治療PDN的生物學靶點提供實驗證據(jù)和理論依據(jù)。

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