靈芝活性組分在小鼠體內(nèi)的降糖功效研究

包 焜，陳 萍，畢云楓，王佳男，方洪帥，苗玉強

（吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，長春130118）

靈芝活性組分在小鼠體內(nèi)的降糖功效研究

包 焜，陳 萍，畢云楓，王佳男，方洪帥，苗玉強

（吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，長春130118）

為了探究靈芝活性組分靈芝多肽、多糖的降血糖機理，采用四氧嘧啶建立糖尿病小鼠模型，經(jīng)不同組分靈芝提取物灌胃連續(xù)4周后測定空腹血糖值、胰島素濃度、肝糖原、肌糖原含量、肝臟SOD活性MDA含量。結(jié)果表明，靈芝多糖能有效增加小鼠血清胰島素濃度（P＜0.05）；靈芝多肽和多糖可顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖含量，降糖率分別為19.1%和29.8%；顯著增強小鼠肝臟SOD活性（P＜0.05，升高率分別為13.4%和19.7%；降低肝臟MDA含量（P＜0.05，且分別降低了27.8%和35.1%。

靈芝；多肽；多糖；血糖；胰島素

近年來隨著寵物食品構(gòu)成以及飼喂方式的改變，犬貓?zhí)悄虿“l(fā)病率也呈現(xiàn)出逐年上升的態(tài)勢。除了傳統(tǒng)的膳食控制和藥物治療外，輔助降糖中藥活性成分治療對糖尿病寵物的血糖調(diào)節(jié)和控制起積極作用，開發(fā)輔助治療糖尿病的寵物食品以及中獸藥有助于預防寵物糖尿病和肥胖癥的發(fā)生，符合我國當前對寵物糖尿病治療方法研究的需求。

靈芝是珍貴的藥用真菌，其中，靈芝多糖是靈芝最重要的活性物質(zhì)，多數(shù)研究側(cè)重其抗癌活性等。1985年，Hikino H研究表明靈芝多糖具有降血糖作用［2］。靈芝肽是靈芝又一重要活性物質(zhì)，具有一定的抗氧化、保肝護肝等活性［3－4］。 孫頡等［5］研究表明靈芝多肽的降血糖效果具有一定的持續(xù)性。本研究開展了靈芝降糖組分靈芝多肽，靈芝多糖及靈芝糖肽混合物對四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠降血糖功能的影響，擬探索其降糖機理，以期為靈芝資源的進一步利用以及促進靈芝降血糖寵物食品及中獸藥的研發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 靈芝粉（批號20140520），吉林健龍生物科技公司；四氧嘧啶（Sigma A7413），北京拜爾迪生物公司；鹽酸二甲雙胍緩釋片（批號：130806），河北山姆士藥業(yè)有限公司；葡萄糖測定試劑盒（批號20140201147）、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（批號20140522，規(guī)格50T／48樣）、丙二醛（MDA）測定試劑盒（批號 20140519，規(guī)格50T／48樣）、糖原測定試劑盒（批號20140530，規(guī)格50T／48樣）、Brodford蛋白測定試劑盒（批號20140416，規(guī)格50T／48樣），南京建成生物工程研究所；胰島素測定試劑盒（批號20140601A），卡爾文生物科技有限公司。

1.2 主要儀器 WD－2102型自動酶標儀，北京市六一儀器廠；H－2050R離心機（大容量），長沙湘儀離心機儀器有限公司；LGJ－12冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；DY89－Ⅱ型電動玻璃勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司；

1.3 藥物制備 將靈芝粉與磷酸鈉緩沖液（pH 7.5）以料液比為1∶10（g∶mL）進行混合，于4℃條件下浸提過夜，4000 r／min離心20 min，取上清液緩慢添加硫酸銨至85%飽和度（沉淀用于提取靈芝多糖），4℃冰箱靜止過夜，5000 r／min離心40 min，沉淀用蒸餾水溶解，透析得到靈芝蛋白提取液，采用堿性蛋白酶對靈芝蛋白進行酶解，酶解條件為酶添加量為680 U／mL，pH 9.43，溫度44.58℃，酶解時間為4.19 h，靈芝蛋白酶解物經(jīng)分子量為10000 Da的超濾膜超濾分離后，取膜透過物，采用葡聚糖凝膠Sephadex G－25進行凝膠過濾層析，取組分二凍干，即為靈芝多肽。

將提取靈芝蛋白后余下的物質(zhì)，參照文獻［6］，利用傳統(tǒng)的熱水浸提法，提取靈芝多糖。

1.4 動物分組 選取18～22 g的健康昆明種小鼠，由吉林大學實驗動物中心提供，雌雄各半，適應性喂養(yǎng)3 d后，禁食12 h。以200 mg／kg的劑量對小鼠腹腔注射四氧嘧啶生理鹽水溶液。正常飼養(yǎng)3 d后再禁食12 h。眼眶靜脈叢采血，3500 r／min離心10 min，取上清即為血清，采用葡萄糖氧化酶－過氧化物酶法，按試劑盒說明操作，測定小鼠空腹血糖值。選用空腹血糖值在11.1～26.1 mmol／L的小鼠為糖尿病模型小鼠。

取建模成功小鼠60只，每組12只，雌雄各半，分為模型對照組（灌胃生理鹽水）、陽性藥物組（700 mg／kg）靈芝多肽組（300 mg／kg）、靈芝多糖組（700 mg／kg）和靈芝糖肽復合組（多糖700 mg／kg＋多肽300 mg／kg）［5］另取健康昆明種小鼠12只（雌雄各半）為正常對照組（灌胃生理鹽水）。按0.1 mL／10 g體重灌胃，每天1次，連續(xù)28 d。在試驗的第0、1、2、3、4周，對各組小鼠眼眶靜脈叢取血（取血前禁食12 h），測定空腹血糖值。

1.5 指標測定 空腹血糖值、血清胰島素濃度、肝糖原、肌糖原、肝臟超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）以及肝臟丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的測定均參照文獻［7］，按試劑盒說明操作。

1.6 統(tǒng)計分析 采用IBM SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)均采用單因素anova方差分析。結(jié)果用均值±標準差（±s，n＝12）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝降糖組分對糖尿病模型小鼠空腹血糖值的影響 靈芝多糖組小鼠與模型對照組相比，血糖從第一周開始顯著降低（P＜0.05），靈芝多肽組和靈芝混合組小鼠血糖從第二周開始顯著降低（P＜0.05），至第四周時，靈芝多肽組、多糖組及混合組的血糖降低率分別為19.1%，29.8%和35.7%，后兩者的降糖效果與陽性藥物組相比差異不顯著（P＞0.05）。

表1 靈芝提取物對糖尿病模型小鼠空腹血糖值的影響結(jié)果表

2.2 靈芝降糖組分對糖尿病模型小鼠胰島素濃度的影響 與正常對照組相比，四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠的血清胰島素水平顯著降低（P＜0.05）；靈芝糖肽混合物升高糖尿病小鼠血清胰島素濃度的幅度最大，與模型對照組相比，升高了 26.9%（P＜0.05），與陽性藥物組相比差異不顯著（P＞0.05）；靈芝多肽組小鼠血清胰島素濃度略有升高，但與模型對照組相比，差異不顯著（P＞0.05）。

表2 靈芝提取物對糖尿病模型小鼠胰島素濃度的影響結(jié)果表

2.3 靈芝降糖組分對糖尿病模型小鼠肝糖原、肌糖原含量的影響 與模型對照組相比，靈芝糖肽混合物組糖尿病小鼠肝糖原含量增加了13.2%（P＜0.05），而靈芝多糖組和靈芝多肽組小鼠肝糖原含量變化均不顯著（P＞0.05）。與模型對照組相比，靈芝多肽、多糖及糖肽復合物均可輕度增加糖尿病小鼠肌糖原含量，但與模型對照組相比，差異不顯著（P＞0.05）。

表3 靈芝提取物對糖尿病模型小鼠肝糖原、肌糖原含量的影響結(jié)果表

2.4 靈芝降糖組分對糖尿病模型小鼠肝臟SOD和MDA的影響 與正常對照組相比，四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的明糖尿病小鼠肝臟SOD活力顯著降低（P＜0.05），肝臟MDA含量顯著升高（P＜0.05）。與模型對照組相比，靈芝多肽組、多糖組及糖肽混合組小鼠的肝臟SOD活力分別升高了13.4%，19.7%和28.4%。（P＜0.05），且靈芝多糖組及糖肽混合組與陽性藥物組相比差異不顯著（P＞0.05）。與模型對照組相比，靈芝糖肽混合組小鼠肝臟MDA含量降低率最明顯（P＜0.05），降低了50.6%，與陽性藥物組相比差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 靈芝提取物對糖尿病模型小鼠肝臟SOD和MDA的影響

3 討論

目前發(fā)現(xiàn)的降血糖的機理主要為兩個方面，一個是對激素水平的調(diào)節(jié)作用，另一個是對糖代謝過程中的酶活性的調(diào)節(jié)作用。氧化應激是指體內(nèi)活性氧化物質(zhì)的產(chǎn)生和抗氧化防御體系之間失衡，從而導致組織損傷的一種狀態(tài)［8］。已有大量研究表明，機體的氧化應激水平和糖尿病之間關系密切［9］，氧化應激在介導胰島細胞凋亡過程中以及對糖尿病的發(fā)生和發(fā)展起著關鍵性作用。

本研究主要通過檢測糖尿病小鼠糖代謝過程中以及反映氧化應激水平的重要指標，來評價靈芝降糖組分的降糖效果，從而分析其降糖機理。首先，在構(gòu)建糖尿病模型時需要注意，糖尿病小鼠建模后第3 d，血糖值太高會導致小鼠的死亡，太低則糖尿病癥狀不明顯，均視為建模失敗。有關研究表明，小鼠空腹血糖值在11.1～26.1 mmol／L為理想模型［6］。本試驗所選糖尿病小鼠模型初始血糖值均在11.1～26.1 mmol／L之間，糖尿病癥狀明顯且死亡率低。試驗研究發(fā)現(xiàn)靈芝多肽，多糖及糖肽混合物均能有效的降低糖尿病小鼠的空腹血糖，且靈芝多糖及靈芝糖肽復合物的降血糖效果要與陽性藥物鹽酸二甲雙胍相當。試驗結(jié)果表明，靈芝多肽對糖尿病小鼠有顯著地降血糖作用，這與孫頡等［5］的試驗結(jié)論相一致，但孫頡等并未對其降糖機理進行深入研究，而據(jù)試驗結(jié)果分析，靈芝多肽可以降低糖尿病小鼠血糖的原因主要有兩方面，本試驗前期已經(jīng)進行了靈芝多肽對體外α－葡萄糖苷酶抑制活性的研究，靈芝多肽可以通過抑制小腸中α－葡萄糖苷酶的活性，減少血液中葡萄糖來源，從而降低血糖含量；其次，根據(jù)本研究試驗中SOD和MDA的數(shù)據(jù)分析可知，靈芝多肽可以通過增強肝臟細胞中SOD的活性，減少有害物質(zhì)MDA的生成，增強機體抗氧化能力，保護糖尿病小鼠胰島B細胞免受自由基和活性氧的進一步破壞，使胰島素的合成和分泌有所升高，從而降低血糖含量。而靈芝多糖除可以增強糖尿病小鼠肝臟SOD活力，降低MDA的含量（P＜0.05），增強糖尿病小鼠機體抗氧化能力之外，可能主要通過改善或修復受損傷的胰島B細胞，使血清胰島素的合成和分泌升高，進而起到降低血糖的作用，張玲芝等［10］在靈芝多糖降血糖的機理研究中也得出了相同的結(jié)論。試驗結(jié)果同樣表明，靈芝糖肽混合物組在降低糖尿病小鼠血糖，升高血清胰島素濃度以及提高小鼠肝糖原含量方面，效果均優(yōu)于靈芝多肽組及靈芝多糖組，且效果接近于鹽酸二甲雙胍陽性藥物組，說明靈芝多肽和多糖在降低糖尿病小鼠血糖方面具有一定的協(xié)同作用［11］，這與孫頡等［5］的試驗結(jié)論不一致，可能是因為孫頡等采用的是茶多糖與靈芝多肽復合降糖，而本試驗采用的是靈芝多糖與靈芝多肽復合降糖的原因。

靈芝多肽，多糖及糖肽混合物均能有效持續(xù)的降低糖尿病小鼠的空腹血糖，提高機體抗氧化能力，減少氧化應激導致的機體損傷，改善了糖尿病的發(fā)生發(fā)展，因此，本研究對靈芝降血糖功能性食品以及治療寵物糖尿病中獸藥的開發(fā)具有良好的理論參考和應用價值。

［1］Canadian Diabetes Association 2008 clinical practice guidelines for the prevention and management of diabetes in Canada［M］.Canadian Diabetes Association，2008.

［2］Hikino H，Konno C，Mirin Y，et al.Isolation and Hypoglycemic Activity of Ganoderans A and B［J］.Planta medica，1985，51（04）：339－340.

［3］Shi Y，Sun J，He H，et al.Hepatoprotective effects of Ganoderma lucidum peptides against d－galactosamine－induced liver injury in mice［J］.Journal of Ethnopharmacology，2008，117（3）：415－419.

［4］黃生權(quán)，敖 宏，曾凡逵，等.靈芝蛋白酶解產(chǎn)物分析及其抗氧化活性的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2013，29（1）：24－28.

［5］孫 頡，何 慧.靈芝肽對實驗性糖尿病小鼠的治療作用［J］.食品科學，2002，23（11）：133－135.

［6］Chen X P，Wang W X，Li S B，et al.Optimization of ultrasound－assisted extraction of Lingzhi polysaccharides using response surface methodology and its inhibitory effect on cervical cancer cells［J］.Carbohydrate Polymers，2010，80（3）：944－948.

［7］郭元日.發(fā)酵人參對四氧嘧啶誘導糖尿病小鼠的療效學研究［D］.延邊大學，2013：6－8.

［8］Anwar M M，Meki A R.Oxidative stress in streptozotocin－induced diabetic rats：effects of garlicoil and melatonin［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part A：Molecular and Integrative Physiology，2003，135（4）：539－547.

［9］林 龍，常建波，孫煜煊.孔石莼多糖降血糖作用研究［J］.食品科技，2012（6）：224－227.

［10］張玲芝，馮 磊.靈芝多糖降血糖的機理探討［J］.福建醫(yī)藥雜志，2004，26（3）：137－140.

［11］滕寶松.靈芝有效降糖組分的篩選及降血糖機理研究［D］.復旦大學，2012：27.

（編 輯：陳 希）

Hypoglycemic Effect of Ganoderma Lucidum Active Component

BAO Kun，CHEN Ping，BI Yun－feng，WANG Jia－nan，F(xiàn)ANG Hong－shuai，MIAO Yu－qiang
（Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun130118，China）

Test is designed to explore the mechanism of Ganoderma lucidum hypoglycemic active components，Ganoderma lucidum peptides and polysaccharide.The diabetic mice model was established by using alloxan.The diabetic mice were orally given with different Ganoderma lucidum extracts for four weeks.The fasting blood glucose（FBG）concentrations，insulin concentrations，content of liver glycogen and muscle glycogen，hepatic SOD and MDA level were measured.The results showed that Ganoderma lucidum polysaccharide significantly increased the insulin concentrations of the diabetic mice（P＜0.05）.Ganoderma lucidum peptides and polysaccharide all significantly decreased the FBG of diabetic mice by 19.1%and 29.8%，respectively（P＜0.05）.Improved the activity of hepatic SOD by 13.4%，19.7%，respectively（P＜0.05）.Decreased the level of hepatic MDA significantly by 27.8%，35.1%，respectively（P＜0.05）.

Ganoderma lucidum；peptides；polysaccharide；FBG；insulin

2014－10－18

A

1002－1280（2015）01－0029－04

S853.74

包 焜，碩士研究生，從事食品科學方向研究。E－mail：157092463＠qq.com