楊　軍，戴頌陽，李　昱，張　雄(重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心，病理教研室，重慶400016)

過表達腦紅蛋白抑制雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦中Aβ誘導(dǎo)的凋亡*

楊軍，戴頌陽，李昱，張雄△
(重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心，病理教研室，重慶400016)

［摘要］目的:研究AD雙轉(zhuǎn)基因(APPswe/PS1dE9)小鼠側(cè)腦室注射質(zhì)粒pNGB后，過表達腦紅蛋白(neuroglobin，NGB)對Aβ誘導(dǎo)的AD小鼠腦中細胞凋亡的影響及其潛在機制。方法:將24只鑒定后的13月齡AD雙轉(zhuǎn)基因陽性小鼠(雌雄各半)隨機分為對照組、側(cè)腦室注射生理鹽水+ pcDNA3.1(1 g/L)組和側(cè)腦室注射pcDNA3.1(1 g/L)+ pNGB組。采用免疫組化檢測鼠腦Aβ(1-42)表達情況，TUNEL染色檢測腦內(nèi)細胞的凋亡情況; Western blot檢測鼠腦內(nèi)與凋亡密切相關(guān)的cleaved caspase-3、caspase-9以及PI3K、p-Akt、Akt的蛋白水平。結(jié)果:與對照組和注射生理鹽水組比較，注射pNGB組小鼠腦內(nèi)Aβ(1-42)的表達明顯受到抑制(P＜0.01)，TUNEL染色陽性細胞數(shù)也明顯減少(P＜0.01) ;過表達NGB能夠明顯抑制腦組織內(nèi)cleaved caspase-3和caspase-9的蛋白表達(P＜0.01)，促進Akt磷酸化水平的增強(P＜0.01)。結(jié)論: pNGB過表達能夠明顯抑制Aβ的生成并抑制Aβ誘導(dǎo)的細胞凋亡，其機制可能與激活PI3K/Akt通路進而抑制與凋亡密切相關(guān)的cleaved caspase-3和caspase-9的表達有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］腦紅蛋白; Caspases; PI3K/Akt通路;阿爾茨海默病

［修回日期］2015-08-05

腦紅蛋白(neuroglobin，NGB)是一類新型攜氧的球蛋白家族，其廣泛分布于人體，包括大腦皮質(zhì)、海馬、丘腦、下丘腦和小腦以及一些內(nèi)分泌器官。以往眾多的研究大多集中在NGB對腦缺血、缺氧的神經(jīng)保護作用及其機制的探討，比如中風(fēng)［1］。近來，新的研究已經(jīng)證實NGB在阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)中也具有神經(jīng)保護作用［2］，但其確切的分子機制尚不清楚。

眾所周知，AD是最為常見的神經(jīng)進行性退行性變性疾病，其三大主要病理特征包括老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元丟失，而神經(jīng)元的丟失主要表現(xiàn)為神經(jīng)元細胞凋亡［3］。與凋亡密切相關(guān)的caspases家族是一類特異的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，它的激活是凋亡機制最關(guān)鍵的事件之一。Caspases家族成員眾多，其中caspase-9作為凋亡的啟動因子和caspase-3作為凋亡的執(zhí)行者在凋亡的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。因此，如何抑制caspases相關(guān)的神經(jīng)元凋亡可能成為預(yù)防和治療AD的關(guān)鍵策略［4］。

我們前期體外實驗已經(jīng)證實了NGB可以通過抑制水溶性Aβ1-42處理的SH-SY5Y細胞內(nèi)caspase-3 和caspase-9的表達進而抑制細胞的凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，但其確切的機制不清。有研究表明NGB是一個PI3K/Akt信號通路的誘導(dǎo)劑［5］，因此，本實驗以雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠為研究對象，通過側(cè)腦室注射pNGB，觀察過表達NGB對腦內(nèi)神經(jīng)元的保護作用，并探討其機制，為NGB防治AD提供更加可靠的理論依據(jù)。

材料和方法

1實驗動物及鑒定

雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠(HuAPP695swe/PS1-dE9)購自南京模式動物研究所，所有的小鼠均放在塑料籠子(每籠3～4只)，給予SPF級飼養(yǎng)室專用鼠糧和水飼養(yǎng)，濕度為(50±10) %、光照12 h明暗交替、溫度設(shè)置為23℃±1℃。

采用李國營等［6］報道的實驗方法并適當(dāng)改進后對雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠進行鑒定。將1月齡小鼠的鼠尾末梢剪下約0.5 cm，參照組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA進行PCR反應(yīng)擴增APP和PS1基因。APP的上游引物為5’-GAC TGA CCA CTC GAC CAG GTT CTG-3’，下游引物為5’-CTT GTA AGT TGG ATT CTC ATA TCC G-3’，產(chǎn)物大小為350 bp; PS1的上游引物為5’-AAT AGA GAA CGG CAG GAG CA-3’，下游引物為5’-GCC ATG AGG GCA CTA ATC AT-3’，產(chǎn)物大小為608 bp。反應(yīng)總體系為25 μL: 2×Taq Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8 μL，上游引物和下游引物各1 μL，基因組DNA 2.5 μL。反應(yīng)條件: 94℃3 min; 94℃30 s，56 ℃1 min，72℃1 min，循環(huán)35次; 72℃5 min，4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR結(jié)果。

2動物分組、側(cè)腦室注射及取材

選取24只13月齡AD小鼠，雌雄各半，隨機分為3組:側(cè)腦室注射生理鹽水(NS)組、注射NS+ pcDNA3.1(1 g/L)組和注射pcDNA3.1(1 g/L)+ pNGB(20 μg)組。具體方法為用3.5%水合氯醛(350 mg/kg)對小鼠進行腹腔麻醉，然后用立體定位儀固定小鼠頭部，將一條聚乙烯管子植入側(cè)腦室(位置為前囟后0.2 mm，橫向1.3 mm，腹側(cè)2.5 mm)，然后固定在顱骨上。用微量注射器按實驗設(shè)計將不同物質(zhì)注入側(cè)腦室，每周1次，連續(xù)8周。

將所有小鼠麻醉后固定于手術(shù)板上，迅速剪開皮膚和腹膜，暴露心臟和主動脈弓，灌注穿刺針從心尖刺入左心室并伸至主動脈根部，止血鉗固定后用灌注機將PBS從左心室灌入，同時剪開右心耳使血液流出，當(dāng)右心耳流出無色液體，肝臟變白時，在冰上快速斷頭取腦，分為左右兩半，一半用多聚甲醛固定，用于形態(tài)學(xué)檢測;另一半置于EP管內(nèi)，于－80℃保存，用于Western blot檢測。

3實驗方法

3.1免疫組織化學(xué)法取小鼠大腦切片，經(jīng)脫蠟處理后，按照SP免疫組化試劑盒說明書進行染色:切片經(jīng)PBS緩沖液沖洗后，置于檸檬酸鹽(0.01 mol/L)中微波修復(fù)20 min以暴露抗原，再放入3%的H2O2中15 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，經(jīng)正常山羊血清封閉液封閉20 min后加入兔抗鼠Aβ1-42多克隆抗體(1∶100稀釋)，4℃過夜。第2天于37℃復(fù)溫1 h后加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孵育30 min后加入HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，37℃孵育30 min，最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

3.2TUNEL染色切片脫蠟、水化后，按照凋亡原位檢測試劑盒(凱基)說明書進行TUNEL染色: PBS 洗3遍，4%多聚甲醛固定并PBS洗2遍;用Proteinase K進行細胞通透30 min; PBS洗2遍后用平衡液進行平衡10 min;加TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上，加蓋玻片37℃反應(yīng)1 h;加入2×SSC液終止反應(yīng)后PBS洗3遍后進行封閉;最后行DAB染色并用蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片觀察。

3.3Western blot稱取10 mg腦組織，加入100 μL PRO-PREPTM蛋白提取液，－20℃放置20 min，13 000×g離心5 min，收集上清，Bradford法檢測蛋白濃度，經(jīng)10% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含0.5 g/L脫脂奶粉的TBST液室溫封閉1 h; 用NGB(1∶250)、PI3K(1∶500)、p-Akt(1∶500)、Akt (1∶500)、cleaved caspase-3 (1∶500)、caspase-9 (1∶500)和β-actin(1∶5 000)抗體孵育，4℃冰箱孵育過夜后用TBST洗3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)，室溫孵育2 h，ECL法顯影后用凝膠化學(xué)成像系統(tǒng)分析其灰度值。

4統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準差(mean±SD)表示。使用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件對各組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，使用單因素方差分析比較組間的差異。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 APPswe/PSEN1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定

在長波紫外光下觀察瓊脂糖凝膠上的PCR條帶，在350 bp和608 bp處均出現(xiàn)條帶者即為APP/PS1陽性雙轉(zhuǎn)基因小鼠，見圖1。

Figure 1.Photograph of PCR products after agarose gel electrophoresis showed the genotype of double transgenic AD (APPswe/PSEN1dE9) mice for identification.圖1 APPswe/PSEN1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定圖

2側(cè)腦室注射后小鼠腦內(nèi)NGB的表達情況

如圖2所示，用Western blot檢測轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)側(cè)腦室注射不同物質(zhì)后腦內(nèi)的NGB蛋白水平的表達情況。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小鼠側(cè)腦室注射生理鹽水和pcDNA3.1后，腦內(nèi)NGB的表達水平?jīng)]有顯著差異;而側(cè)腦室注射pNGB后，腦內(nèi)NGB的蛋白表達水平顯著增加(P＜0.01)。

3過表達NGB明顯降低AD小鼠腦內(nèi)Aβ的產(chǎn)生

NS組，Aβ斑主要分布于腦皮質(zhì)和海馬區(qū)，它們比較大、圓形、緊湊而且邊界清楚，一些斑塊的中心有淺的染色區(qū)，其Aβ斑塊在海馬區(qū)占約0.54%± 0.13%，在皮質(zhì)區(qū)占約1.36%±0.16%;側(cè)腦室注射pcDNA3.1+ NS組，Aβ斑分別占約0.51%± 0.10%、1.34%±0.21%;而在注射pNGB組，其Aβ斑塊明顯減少，各自約占0.37%±0.09%、1.08%± 0.12%，明顯低于NS組(P＜0.01)，見圖3。

Figure 2.The expression of NGB in the brains of transgenic mice after intracerebroventricular injection.Mean±SD.n=4.*P＜0.01 vs NS group.圖2側(cè)腦室注射后轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)NGB的表達情況

4過表達NGB明顯降低AD小鼠腦內(nèi)凋亡細胞

TUNEL染色結(jié)果顯示，側(cè)腦室注射NS組和pcDNA3.1+ NS組的海馬區(qū)及皮質(zhì)區(qū)TUNEL染色陽性細胞數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異;而注射pNGB后，TUNEL染色陽性細胞明顯減少，與NS組和pcDNA3.1組比較差異顯著(P＜0.01)，見圖4。

5過表達NGB通過PI3K/Akt通路抑制cleaved caspase-3和caspase-9蛋白的表達

如圖5所示，與側(cè)腦室注射NS和pcNDA3.1+ NS兩組轉(zhuǎn)基因小鼠相比，注射pNGB+ pcDNA3.1的轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的cleaved caspase-3和caspase-9蛋白表達水平明顯受到抑制(P＜0.01) ;而PI3K和p-Akt的蛋白水平明顯增加(p＜0.01)，而總Akt水平卻沒有顯著改變。

Figure 3.Comparison of Aβ production and Aβ positive areas in the hippocampus and cortex of transgenic mice after intracerebroventricular injection.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs NS group.圖3側(cè)腦室注射后，轉(zhuǎn)基因小鼠海馬和皮質(zhì)區(qū)Aβ斑生成情況及面積大小的比較

Figure 4.Comparison of TUNEL positive cells in the hippocampus and cortex of transgenic mice after intracerebroventricular injection (×200).Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs NS group.圖4側(cè)腦室注射后，轉(zhuǎn)基因小鼠海馬和皮質(zhì)區(qū)TUNEL陽性細胞的比較

Figure 5.The protein levels of cleaved caspase-3，caspase-9，Akt，p-Akt and PI3K in the brains of transgenic mice after intracerebroventricular injection.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs pcDNA3.1+ pNGB group.圖5側(cè)腦室注射后，轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)cleaved caspase-3、caspase-9、Akt、p-Akt和PI3K蛋白的表達

討論

NGB是一類新型的攜氧球蛋白，廣泛存在于腦內(nèi)，特別高表達于神經(jīng)元，而在一些內(nèi)分泌和視桿細胞也有少量表達。以前的研究已證明過表達NGB可以抵抗Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元的凋亡，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護作用［7］，但其具體的分子機制還未闡明。我們前期體外實驗通過水溶性Aβ1-42處理SH-SY5Y細胞建立了AD的細胞模型，轉(zhuǎn)染pNGB發(fā)現(xiàn)，過表達的NGB不僅能夠促進細胞的生長，而且還能夠保護細胞的膜電位，抑制細胞的凋亡，進一步研究其機制發(fā)現(xiàn)NGB可以抑制細胞內(nèi)cleaved caspase-3和caspase-9的表達，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護作用，但確切的分子機制仍需要進一步證明［8］。因此，本課題的目的就是通過在體以雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠為研究對象，側(cè)腦室注射pNGB，觀察過表達NGB對Aβ的產(chǎn)生以及Aβ誘導(dǎo)細胞凋亡的作用，并探討其潛在的分子機制損傷的作用，為NGB防治AD提供更加可靠的理論依據(jù)。

一般來說，NGB水平會隨著年齡的增加而降低。Sun等［9］從AD病人尸檢研究中發(fā)現(xiàn)，在AD早期NGB開始增加，進展期明顯增加，而到嚴重AD時，NGB的水平則降低到正常對照或以下，這說明NGB 在AD患者的腦內(nèi)是一個動態(tài)變化的過程，早期至中期是增加的，而晚期則是明顯減少的。因此，本實驗以13月齡的AD小鼠為研究對象，通過Western blot實驗證實NGB的表達較低，側(cè)腦室注射pNGB后其表達水平明顯增多，因此可開展后續(xù)實驗。

過多的Aβ在腦皮質(zhì)內(nèi)沉積不僅可導(dǎo)致老年斑的形成，而且還能誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡，兩者都是AD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，因此，如何抑制Aβ的產(chǎn)生進而延遲或阻止神經(jīng)元的凋亡可能將成為防治AD的重要策略。本研究分別通過免疫組化和TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，相較于側(cè)腦室注射NS和pCDNA3.1組，側(cè)腦室注射pNGB后，過表達的NGB能夠明顯降低小鼠海馬和皮質(zhì)內(nèi)Aβ斑的產(chǎn)生以及細胞的凋亡。

自從2000年發(fā)現(xiàn)NGB以來，NGB潛在的作用靶點以及在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護作用的準確機制仍不清楚，存在著多種學(xué)說。許多學(xué)者認為NGB可以增加氧容量，因為NGB本身就是一類新型攜氧球蛋白，它具有與血紅蛋白、肌紅蛋白相似的功能。然而進一步的研究表明NGB能快速地自我氧化，與氧的結(jié)合率極低［10］。其次，NGB是一個NO清除劑［11］，可通過清除NO、氧自由基等有害物質(zhì)，發(fā)揮其抗氧化的功能。第三，NGB具有抗凋亡作用，可抑制死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Rac-1介導(dǎo)的肌動蛋白組裝和聚集，也可抑制caspase的活性［12］。

Caspase的活性激活被認為是凋亡機制中最關(guān)鍵的一步。許多研究表明caspase的激活與AD的病理生成緊密相關(guān)。Li等［13］觀察到:過多的Aβ誘導(dǎo)星狀細胞和小腦顆粒細胞凋亡時，caspase-2、3、6水平增加; Francois等［14］證實APP有3個caspase剪切位點: (P4) DNVD 197 (P1 )/S、(P4 ) DYAD219 (P1)/G、(P4) VEVD720 (P1)/A; Raina等［15］也發(fā)現(xiàn)了caspase-3的激活導(dǎo)致β-APP的剪切，增加AD病人腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元內(nèi)的Aβ的產(chǎn)生和老年斑的形成。這些都表明激活caspase可以損害腦內(nèi)APP的正常代謝，導(dǎo)致過多的Aβ產(chǎn)生和沉積。Aβ又促進caspase激活，剪切APP，進而形成一個惡性循環(huán)。因此，我們認為抑制caspase的活性可降低Aβ的產(chǎn)生，并抑制細胞凋亡。本實驗結(jié)果顯示，相較于側(cè)腦室注射NS和pCDNA3.1組，注射pNGB后，過表達NGB能夠明顯降低AD小鼠腦內(nèi)cleaved caspase-3 和caspase-9的表達。

最近，有學(xué)者應(yīng)用高濃度的PI3K抑制劑阻斷Akt的磷酸化，從而減少caspase-9蛋白的磷酸化，抑制其下游分子引起的一系列串聯(lián)反應(yīng)而抑制凋亡進程，而促進神經(jīng)干細胞的存活［16］。這表明活化PI3K/Akt對其下游靶基因的調(diào)節(jié)作用是促進細胞生存的一個重要途徑，為中樞神經(jīng)退行性疾病的治療提供了一個潛在的作用靶點［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室注射NGB后，過表達NGB能夠促進AD小鼠腦內(nèi)PI3K、Akt磷酸化水平的增強，這說明NGB也有可能通過激活PI3K/Akt信號通路，進而抑制下游靶基因caspases的活性而抑制神經(jīng)元的凋亡，從而保護神經(jīng)元。

總之，NGB不僅降低了AD小鼠腦內(nèi)Aβ的產(chǎn)生，也減輕Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡和細胞壞死。其潛在的機制可能是通過激活PI3K/Akt信號通路，進而抑制下游靶基因caspase的活性而發(fā)揮其神經(jīng)保護作用，這將為NGB防治AD提供新的理論依據(jù)，也將為AD藥物治療提供新的靶點。

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(責(zé)任編輯:陳妙玲，羅森)

Overexpression of neuroglobin attenuates Aβ-induced apoptosis in brains of double transgenic AD mice

YANG Jun，DAI Song-yang，LI Yu，ZHANG Xiong
(Institute of Neuroscience＆Department of Pathology，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China.E-mail: zhangxiong_0@aliyun.com)

［ABSTRACT］AIM: To observe the effects of neuroglobin (NGB) overexpression on the apoptosis induced by Aβ in the brains of double transgenic AD (APPswe/PS1dE9) mice and to explore its potential mechanisms.METHODS: Twenty-four 13-month-old double transgenic AD mice were randomly divided into 3 groups: intracerebroventricular injection with normal saline (NS) group，intracerebroventricular injection with pcDNA3.1 and NS group，and intracerebroventricular injection with pcDNA3.1 and pNGB group.Immunohistochemistry was used to detect the expression of Aβ(1-42)in the brains.TUNEL staining was used for analyzing the apoptosis，and the protein levels of cleaved caspase-3，caspase-9，PI3K，Akt and p-Akt were determined by Western blot.RESULTS: After intracerebroventricular injection with pNGB，the areas of Aβ(1-42)in the hippocampus and cortex were decreased compared with NS group and pcDNA3.1+ NS group (P＜0.01).The TUNEL-positive staining cells in the pNGB group were less than those in NS group and pcDNA3.1 group (P＜0.01).NGB overexpression attenuated the protein levels of cleaved caspase-3 and caspase-9 (P＜0.01)，but induced the production of PI3K and p-Akt (P＜0.01).CONCLUSION: Overexpression of pNGB significantly inhibits the generation of Aβ and attenuates the apoptosis induced by Aβ，indicating that NGB overexpression activates PI3K/Akt pathway and inhibits the production of cleaved caspase-3 and caspase-9，which were tightly related with apoptosis.

［KEY WORDS］Neuroglobin; Caspases; pI3K/Akt pathway; Alzheimer disease

通訊作者△Tel: 023-68485868; E-mail: zhangxiong_0@aliyun.com

*［基金項目］國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項目(No.81100948)

［收稿日期］2015-03-04

［文章編號］1000-4718(2015)09-1621-06

［中圖分類號］R363

［文獻標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.016