陽　帆，周麗麗，曹艷華，楊志英，鄺　婧，張園園，李　堅△(湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，郴州市第一人民醫(yī)院兒童醫(yī)院，湖南郴州4000;清遠市獅子湖醫(yī)院，廣東清遠550)

不可分型流感嗜血桿菌誘導(dǎo)NCI-H292細胞產(chǎn)生MUC5AC的分子機制*

陽帆1，周麗麗2，曹艷華1，楊志英1，鄺婧2，張園園3，李堅1△
(1湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，2郴州市第一人民醫(yī)院兒童醫(yī)院，湖南郴州423000;3清遠市獅子湖醫(yī)院，廣東清遠511520)

［摘要］目的:探討不可分型流感嗜血桿菌(nontypeable Haemophilus influenzae，NTHi)誘導(dǎo)氣道上皮細胞表達黏蛋白MUC5AC的影響，并探討其可能的分子機制。方法:體外培養(yǎng)NCI-H292細胞，用NTHi感染后，采用ELISA檢測MUC5AC和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的水平;明膠酶譜實驗分析MMP-9的酶活性;同時分別采用表皮生長因子受體(EGFR)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、NADPH氧化酶、活性氧簇(ROS)、和MMP-9特異性抑制劑AG1478、LY294002、DPI、NAC和GM6001預(yù)處理NCI-H292細胞，檢測MUC5AC以及MMP-9的水平。結(jié)果: NTHi能以時間依賴性方式誘導(dǎo)NCI-H292細胞產(chǎn)生MMP-9，并上調(diào)其酶活性，同時增加Rac1的活性并誘導(dǎo)ROS生成;采用AG1478和LY294002處理后，Rac1活性顯著降低;采用DPI或Rac1抑制劑NSC23766處理后，ROS含量明顯減少;當(dāng)NCI-H292細胞用NAC或NSC23766預(yù)處理后，可顯著下調(diào)MMP-9的表達與活性。此外，采用GM6001處理后，MUC5AC的分泌明顯降低。結(jié)論: NTHi經(jīng)EGFR/PI3K/Rac1/NADPH氧化酶/ROS/MMP-9通路誘導(dǎo)NCIH292細胞產(chǎn)生MUC5AC。

［關(guān)鍵詞］不可分型流感嗜血桿菌;基質(zhì)金屬蛋白酶9; MUC5AC

［修回日期］2015-07-08

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是世界上第4位主要死亡原因［1］。呼吸道黏液過度分泌是導(dǎo)致COPD急性發(fā)作的重要因素［2］。作為機體抵御外來病原體感染的重要保護屏障，呼吸道黏膜分泌的黏液在固有免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用［2-3］。黏蛋白是黏液的重要組成成分，但病理條件下黏蛋白過度表達往往會導(dǎo)致呼吸受限或換氣不足［2，4］。在已經(jīng)明確的20多種黏蛋白中，以凝膠黏蛋白MUC5AC研究最多［5］。研究表明，MUC5AC在肺部表達較高，多種細菌感染均可促進其分泌，如不可分型流感嗜血桿菌(nontypeable Haemophilus influenzae，NTHi)和銅綠假單胞菌等［6-8］。研究顯示，NTHi能通過表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)途徑誘導(dǎo)氣道上皮細胞產(chǎn)生MUC5AC，其機制依賴于基質(zhì)金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinase 9，MMP-9)的活性［9-10］。但其上游的分子機制目前仍不清楚。本研究旨在進一步探討NTHi誘導(dǎo)人氣道上皮細胞產(chǎn)生MMP-9的分子機制，并探討其在介導(dǎo)MUC5AC分泌中的作用。

材料和方法

1試劑與菌株

鼠抗人MUC5AC單克隆抗體、AG1478(EGFR抑制劑)、LY294002(PI3K抑制劑)、DPI (NADPH氧化酶抑制劑)、NAC (ROS抑制劑)和GM6001 (MMP-9特異性抑制劑)購自Sigma; HRP標(biāo)記羊抗鼠多克隆抗體購自Santa Cruz; CM-H2DCFDA熒光探針為Molecular Probes產(chǎn)品; NSC23766購自Tocris; NTHi和NCI-H292細胞株購自ATCC;胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基為Gibco產(chǎn)品。MMP-9 ELISA檢測試劑盒購自R＆D。

2實驗方法

2.1NTHi培養(yǎng)與提取NTHi菌株用巧克力瓊脂于37℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h，PBS洗脫平板上細菌并收集到Eppendorf管中，隨后加入30 mL含3.5 mg/L NAD的腦-心浸液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。4℃10 000 r/min離心10 min，PBS洗滌沉淀2次后用0.22 μm濾膜(Millipore)過濾并保存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2NCI-H292細胞培養(yǎng)人氣道上皮細胞系NCIH292細胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中于5% CO2、37℃的環(huán)境下生長。實驗前，將細胞按密度為5×105/well接種于6孔板中，無血清條件下培養(yǎng)24 h，隨后加入培養(yǎng)的NTHi共感染9 h。在研究抑制劑效應(yīng)時，NCI-H292細胞預(yù)先與相應(yīng)的抑制劑孵育1 h，隨后再用NTHi感染。本研究當(dāng)中所用的抑制劑濃度分別為10 μmol/L (AG1478 )、20 μmol/L (GM6001 )、50 μmol/L (NSC23766 )、50 μmol/L (LY294002)、15 μmol/L(DPI)和30 mmol/L(NAC)。

2.3細胞存活率觀察采用MTT實驗觀察NTHi感染或藥物作用后細胞的存活率。當(dāng)細胞處理結(jié)束前4 h各孔加入MTT溶液20 μL后，隨后棄上清，并加入DMSO，充分混勻，用酶標(biāo)儀測定各孔570 nm處的吸光度值(A570)，并計算細胞的存活率。存活率=實驗組A值/對照組A值×100%。

2.4明膠酶譜實驗細胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，收集上清，加入Laemmli樣品緩沖液并經(jīng)含1 g/L明膠的SDS-PAGE(分離膠10%)分離。電泳結(jié)束后，加入含2.5% Triton X-100復(fù)性液孵育30 min以去除SDS。隨后將凝膠用50 mmol/L HCl (pH 7.4)、5 mmol/L CaCl2和1 μmol/L ZnCl2于37℃下孵育過夜。加入0.05%考馬斯亮藍R-250室溫染色30 min，去離子水脫色，拍照，灰度掃描。MMP-9活性以相對值表示，計算公式為:處理組灰度值/對照組灰度值×100%。

2.5MMP-9蛋白含量分析細胞處理結(jié)束后，通過反復(fù)凍融以裂解細胞。經(jīng)1 000 r/min離心5 min后，棄沉淀，采用雙抗體夾心ELISA法檢測上清中MMP-9的含量。操作方法按照商家提供的試劑盒操作步驟進行。結(jié)果以相對含量表示(處理組MMP-9濃度/對照組MMP-9濃度×100%)。

2.6Rac1活性檢測裂解處理后的NCI-H292細胞，根據(jù)Cytoskeleton生產(chǎn)的G-LISATM Activation Assay試劑盒的操作說明測量Rac1的活性。本試劑盒采用ELISA原理測量小G蛋白中結(jié)合GTP(活性形式)的含量而加以確定。測量組熒光強度/對照組強度的比值即為Rac1的相對活性。

2.7活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)含量的檢測NCI-H292細胞刺激結(jié)束后，加入10 μmol/L CM-H2DCFDA用于檢測自由基的活性。熒光強度采用熒光分光光度計(Hitachi F-2000)進行分析，其中激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm。ROS含量根據(jù)標(biāo)本熒光強度/對照品熒光強度的比值表示。

2.8ELISA檢測MUC5AC的含量采用酶聯(lián)免疫分析測量MUC5AC蛋白的含量。細胞處理結(jié)束后，棄上清，隨后用4℃PBS洗滌細胞。并加入裂解緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl、133 mmol/L NaCl、1% NP-40及10%甘油)裂解細胞。離心獲取裂解上清液并測定其濃度后置于－80℃。檢測MUC5AC時，取裂解上清液置于96孔板中，40℃下烘干。加入2%胎牛血清于37℃封閉1 h，隨后加入含0.05% Tween-20的MUC5AC抗體(PBS稀釋)孵育1 h，結(jié)束后加入Ⅱ抗，37℃1 h。TMB法顯色后，再加入2 N H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀下讀取450 nm下的吸光度。

3統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。計量資料采用t檢驗。組間比較采用單因素方差分析后行SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 NTHi經(jīng)EGFR誘導(dǎo)NCI-H292細胞分泌并激活MMP-9

NCI-H292細胞靜息狀態(tài)下，MMP-9表達量較低。當(dāng)經(jīng)NTHi感染后，能以時間依賴性方式誘導(dǎo)產(chǎn)生MMP-9，當(dāng)感染時間為9 h時，MMP-9含量為對照組的3.7倍。此外，MMP-9的酶活性也隨感染時間的延長而增高。9 h后酶活性為對照組的3.1倍。此外，NCI-H292細胞經(jīng)EGFR抑制劑AG1478處理后，MMP-9蛋白分泌水平減少52.2%，活性降低61.2%，見圖1。在所有處理組中，細胞的存活率無明顯變化(結(jié)果未顯示)。

Figure 1.NTHi induced the secretion and activation of MMP-9 in NCI-H292 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs NTHi(9 h).圖1 NTHi對NCI-H292表達MMP-9及其活性的影響

2 NTHi經(jīng)EGFR和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)通路激活Rac1

NTHi感染NCI-H292細胞后，Rac1活性增加了3.8倍。有研究表明，NTHi感染能激活EGFR和PI3K［11］。為了進一步探討Rac1的激活與EGFR和PI3K的關(guān)系，NCI-H292細胞分別與EGFR和PI3K特異性抑制劑AG1478及LY294002處理。結(jié)果顯示，AG1478處理后Rac1活性降低了54.5%，LY294002能將其活性降低49.2%，見圖2。上述濃度抑制劑處理后對細胞的存活率無明顯影響(結(jié)果未顯示)。

Figure 2.NTHi induced Rac1 activation through EGFR and PI3K.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs NTHi.圖2 NTHi經(jīng)EGFR和PI3K激活Rac1

3 NTHi誘導(dǎo)的MMP-9含量與活性受Rac1和ROS調(diào)控

NCI-H292細胞靜息狀態(tài)下，ROS含量較低。經(jīng)NTHi感染后，ROS含量為對照組的2.3倍。NADPH氧化酶和Rac1抑制劑DPI和HSC23766處理后，ROS水平顯著降低。當(dāng)NCI-H292細胞感染前用ROS特異性抑制劑NAC預(yù)處理后，MMP-9含量減少了56.7%，活性降低了71.4%。此外，NCI-H292細胞用Rac1特異性抑制劑NSC23766預(yù)處理后，MMP-9的含量降低了60.3%，活性降低至68.5%，見圖3。此外，本實驗所用的DPI、HSC23766或NAC處理后對細胞存活率無明顯影響(結(jié)果未顯示)。

4 NTHi誘導(dǎo)的MUC5AC受MMP-9調(diào)控

NTHi感染NCI-H292細胞后，MUC5AC分泌增加了3.8倍。NSC23766、DPI或NAC處理后，MUC5AC分泌降低了65.6%、57.9%和50.0%。MMP-9抑制劑GM6001在不影響細胞存活率的情況下(結(jié)果未顯示)，能明顯減少MUC5AC產(chǎn)生，見圖4。

Figure 3.Rac1 mediated NTHi-stimulated MMP-9 secretion and activation through generation of ROS.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs NTHi.圖3 NTHi經(jīng)Rac1/ROS誘導(dǎo)MMP-9分泌并上調(diào)其酶活性

Figure 4.NTHi-stimulated MUC5AC production was regulated by Rac1/ROS-induced MMP-9 activity.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs NTHi.圖4 NTHi經(jīng)Rac1/ROS/MMP-9誘導(dǎo)MUC5AC產(chǎn)生

討論

盡管有研究顯示NTHi能通過誘導(dǎo)MMP-9調(diào)控MUC5AC生成，但其確切的分子機制目前尚不完全清楚［12-13］。在本研究當(dāng)中，我們對其信號通路進行了探討。首先體外培養(yǎng)NTHi和NCI-H292細胞，通過建立感染模型后發(fā)現(xiàn)，NTHi能以時間依賴性方式誘導(dǎo)MMP-9的表達，并能上調(diào)其酶活性。由于在多種因素所誘導(dǎo)的MMP-9表達受EGFR信號通路的調(diào)節(jié)，因此本研究通過采用EGFR特異性抑制劑AG1478處理后發(fā)現(xiàn)，NTHi誘導(dǎo)MMP-9表達及酶活性作用顯著降低，這表明NTHi誘導(dǎo)MMP-9的產(chǎn)生有賴于EGFR。EGFR激活后可磷酸化下游信號通路PI3K。Rac1是小G蛋白Rho家族成員，其通過GTP結(jié)合的有活性形式和GDP結(jié)合的無活性形式循環(huán)調(diào)節(jié)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在免疫應(yīng)答、肌動蛋白細胞骨架重組和細胞遷移中發(fā)揮重要作用。研究表明，PI3K與Rac1密切相關(guān)。為了進一步探討NTHi感染后EGFR和PI3K對Rac1活化的影響，我們采用AG1478和PI3K抑制劑LY294002處理后，結(jié)果顯示Rac1活性明顯降低，提示PI3K在介導(dǎo)EGFR激活Rac1中發(fā)揮重要作用。而隨后通過抑制Rac1活性后，MMP-9的產(chǎn)生及酶活性也明顯降低。以上結(jié)果表明EGFR下游的信號通路如PI3K依賴性Rac1介導(dǎo)了MMP-9的分泌與激活。

Rac1激活后，可激活下游NADPH氧化酶并誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生［14］。ROS是細胞內(nèi)一種重要的生理物質(zhì)，但在病理條件下ROS的異常增多可導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷。ROS的分泌受NADPH氧化酶調(diào)控。NADPH氧化酶是一個多組分活化的酶復(fù)合體，主要由質(zhì)膜結(jié)合成分(包括gp91phox、p22phox和小GTP酶結(jié)合蛋白Rap1A)及胞漿成分組成(p47phox、p67phox、p40phox、小GTP酶結(jié)合蛋白Rac2、Cdc42等)組成。外源性因素刺激下可誘導(dǎo)NADPH氧化酶胞漿亞基p47phox磷酸化，隨后轉(zhuǎn)位到質(zhì)膜或顆粒體膜，從而組裝成有功能的NADPH氧化酶。NADPH氧化酶隨后通過一系列電子傳遞催化ROS生成［14］。本研究通過采用NADPH氧化酶抑制劑DPI以及Rac1抑制劑處理后，細胞內(nèi)ROS含量明顯減少。這表明NAPDH氧化酶和Rac1參與了NTHi誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。研究表明Rac1和ROS兩者共同調(diào)控MMP-9的分泌與激活［15-17］，為了進一步證明ROS是否也參與了NTHi誘導(dǎo)MMP-9的表達，隨后我們采用ROS抑制劑NAC處理后發(fā)現(xiàn)，MMP-9的分泌及活性明顯受到抑制。最后通過抑制MMP-9的活性后，MUC5AC的分泌顯著降低。以上結(jié)果表明NTHi誘導(dǎo)MUC5AC的表達是通過激活EGFR/PI3K/Rac1/NAPDH氧化酶/ROS/MMP-9通路而實現(xiàn)的。

總之，本研究證實MUC5AC的產(chǎn)生受MMP-9調(diào)控，Rac1在該過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，這為COPD等疾病的治療提供新的作用靶點。但Rac1是機體正常生理功能所必需的分子，尤其是參與了巨噬細胞的吞噬功能［18-19］，因此以Rac1為作用靶點的藥物開發(fā)用于治療COPD等呼吸系統(tǒng)疾病時，必須考慮細胞特異性和可控性問題，以減少其副作用。

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(責(zé)任編輯:盧萍，余小慧)

Molecular mechanism of nontypeable Haemophilus influenzae stimulated MUC5AC production in NCI-H292 cells

YANG Fan1，ZHOU Li-li2，CAO Yan-hua1，YANG Zhi-ying1，KUANG Jing2，ZHANG Yuan-yuan3，LI Jian1
(1Department of Basic Medicine，Xiangnan College of Medicine，2Children＇s Hospital，The First People’s Hospital of Chenzhou，Chenzhou 423000，China;3Lionlake Hospital of Qingyuan，Qingyuan 511520，China.E-mail: okleonlj@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the molecular mechanism of nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) -induced MUC5AC expression in the human airway NCI-H292 cells.METHODS: Bronchial epithelial NCI-H292 cells were cultured in vitro.The production of MUC5AC and matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) after stimulation with NTHi was analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The enzymatic activity of MMP-9 was detected by gelatin zymography.In addition，the cells were pretreated with different inhibitors such as AG1478，LY294002，DPI，NAC and GM6001 before stimulation，which specifically inhibit epidermal growth factor receptor(EGFR)，phosphatiadylinositol 3-kinase (PI3K)，NADPH oxidase，reactive oxygen species (ROS) and MMP-9，respectively，and then the production of MUC5AC or MMP-9 was determined.RESULTS: NTHi-stimulated NCI-H292 cells exhibited a time-dependent increase in MMP-9 secretion and activity.NTHi also increased the activity of Rac1 and the production of ROS.Pretreatment of AG1478 and LY294002 decreased the Rac1 activity，and preincubation of DPI or Rac1 inhibitor significantly abrogated ROS production.In addition，secretion of MMP-9 and the enzymatic activity was decreased by treatment of NAC and NSC23766.Furthermore，inhibition of the MMP-9 activity by GM6001 significantly inhibited MUC5AC production.CONCLUSION: EGFR/PI3K/Rac1/NADPH oxidase/ROS/MMP-9 regulates MUC5AC production in NTHi-challenged NCIH292 cells.

［KEY WORDS］Nontypeable Haemophilus influenzae; Matrix metalloproteinase 9; MUC5AC

通訊作者△Tel: 0735-2653161; E-mail: okleonlj@163.com

*［基金項目］國家自然科學(xué)基金資助項目(No.31300156) ;湖南省教育廳計劃項目(No.09C912) ;湘南學(xué)院“十二五”重點學(xué)科(No.xnu125kd019)

［收稿日期］2015-04-13

［文章編號］1000-4718(2015)09-1642-05

［中圖分類號］R363

［文獻標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.020