Ag85B調(diào)節(jié)小鼠髓樣樹突狀細(xì)胞的成熟和TSLP介導(dǎo)下TSLPR和OX40L的表達(dá)*

錢　江，吳　健，安　弘，房祥峰，李東風(fēng)，楊士芳，孟錦繡，高興林(南方醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣東廣州5055;廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所呼吸內(nèi)科，醫(yī)學(xué)研究中心，廣東廣州50080)

Ag85B調(diào)節(jié)小鼠髓樣樹突狀細(xì)胞的成熟和TSLP介導(dǎo)下TSLPR和OX40L的表達(dá)*

錢江1，2，吳健2△，安弘1，2，房祥峰1，2，李東風(fēng)3，楊士芳2，孟錦繡3，高興林2
(1南方醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣東廣州510515;廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所2呼吸內(nèi)科，3醫(yī)學(xué)研究中心，廣東廣州510080)

［摘要］目的:研究抗原85B(Ag85B)體外誘導(dǎo)小鼠未成熟的髓樣樹突狀細(xì)胞(mDCs)的成熟以及對(duì)胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)介導(dǎo)下mDCs表達(dá)TSLP受體(TSLPR)和OX40L的影響，探究Ag85B抑制哮喘氣道炎癥的可能機(jī)制。方法:應(yīng)用重組小鼠GM-CSF和IL-4體外誘生C57BL/6小鼠未成熟的mDCs，并運(yùn)用免疫磁珠分離的方法純化，采用光鏡和掃描電鏡、流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞表型鑒定;分別用0、50、100、200 μg/L不同濃度的Ag85B或TSLP作用于純化并鑒定后的mDCs，培養(yǎng)24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子CD80、CD86、TSLPR和OX40L的表達(dá)，選取最佳的Ag85B或TSLP處理濃度。隨后將mDCs隨機(jī)分為空白對(duì)照組、Ag85B處理組、TSLP處理組和Ag85B+ TSLP處理組，培養(yǎng)24 h后檢測(cè)mDCs的促炎表面分子TSLPR和OX40L的表達(dá)。結(jié)果:體外誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d，倒置相差顯微鏡下可見細(xì)胞表面呈現(xiàn)不規(guī)則樹突樣突起，掃描電鏡下見細(xì)胞類圓形，表面有少量皺褶和較少分叉的樹突狀突起，符合未成熟mDCs的形態(tài)學(xué)特點(diǎn);純化后的mDCs表達(dá)表面分子CD11c的細(xì)胞較表達(dá)共刺激分子CD80和CD86的細(xì)胞多，符合未成熟mDCs的表型特征。與空白對(duì)照組比較，50～200 μg/L的Ag85B處理組mDCs表達(dá)CD80和CD86的細(xì)胞比率顯著增高(P＜0.05)，表達(dá)TSLPR和OX40L的細(xì)胞比率無顯著差異。與空白對(duì)照組相比較，50、100和200 μg/L濃度的TSLP處理組的mDCs表達(dá)CD80和CD86的細(xì)胞比率均顯著增加(P＜0.05) ;與空白對(duì)照組和50 μg/L TSLP處理組相比較，100 μg/L和200 μg/L TSLP處理組的mDCs表達(dá)TSLPR和OX40L的細(xì)胞比率均顯著升高(P＜0.05)。選取200 μg/L作為Ag85B和TSLP的優(yōu)化作用濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ag85B處理組和Ag85B+ TSLP處理組的mDCs表達(dá)TSLPR和OX40L的細(xì)胞比率較TSLP處理組均顯著降低(P ＜0.05)，與空白對(duì)照組比較差異不顯著。結(jié)論: Ag85B可通過上調(diào)mDCs表達(dá)共刺激分子CD80和CD86促進(jìn)其成熟，同時(shí)下調(diào)TSLP介導(dǎo)的mDCs表達(dá)促炎表面分子TSLPR和OX40L，推測(cè)Ag85B可能通過TSLP介導(dǎo)的mDCs途徑抑制氣道炎癥。

［關(guān)鍵詞］抗原85B;胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素;髓樣樹突狀細(xì)胞;胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素受體; OX40L

［修回日期］2015-07-14

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)分為兩類:髓樣樹突狀細(xì)胞(myeloid dendritic cells，mDCs)，由骨髓中的髓樣前體細(xì)胞分化而來，表達(dá)特異性的標(biāo)記物CD11c;漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cells，pDCs)，由骨髓中的淋巴樣祖細(xì)胞分化而來，主要表達(dá)CD4、CD123和CD68等，而缺乏CD11c［1］。CD4+T細(xì)胞的增殖活化需要來自抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)的兩個(gè)刺激信號(hào)才能被激活發(fā)揮功能，一類由T淋巴細(xì)胞受體與APC主要組織相容性復(fù)合物-抗原肽復(fù)合體相互作用產(chǎn)生的第一信號(hào)(識(shí)別信號(hào))，另一類由APC表面的共刺激分子與T細(xì)胞表面對(duì)應(yīng)受體相結(jié)合產(chǎn)生的第二信號(hào)(共刺激信號(hào))。研究表明，除了B7(CD80 和CD86) -CTLA4/CD28和CD40-CD40L兩對(duì)共刺激分子外，OX40及其配體OX40L在T細(xì)胞初次和再次免疫應(yīng)答中亦發(fā)揮重要作用［2］。

mDCs是機(jī)體重要的專職抗原提呈細(xì)胞，參與哮喘發(fā)病的整個(gè)過程［3］。輔助性T淋巴細(xì)胞(helper T lymphocytes，Th)功能亢進(jìn)、Th1/Th2比例失衡是哮喘氣道炎癥的主要發(fā)病機(jī)制［4］，另外，氣道上皮細(xì)胞應(yīng)激和損傷可觸發(fā)趨化因子和生長(zhǎng)因子的釋放，兩者均參與氣道的慢性炎癥和結(jié)構(gòu)重塑，其中胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)及TSLP受體(thymic stromal lymphopoietin receptor，TSLPR)信號(hào)通路從中發(fā)揮重要的作用［5］。氣道上皮細(xì)胞在過敏原、病毒、物理?yè)p傷等刺激下可分泌大量的TSLP，TSLP作用于mDCs表面的TSLPR促進(jìn)其成熟與活化，活化后的mDCs通過上調(diào)表達(dá)OX40L與初始CD4+T細(xì)胞表面的OX40相互作用促進(jìn)其向Th2分化，最終導(dǎo)致哮喘氣道Th2型炎癥反應(yīng)［6］。

結(jié)核分枝桿菌抗原85B(antigen 85B，Ag85B)是分支桿菌屬或卡介苗(bacille calmette guerin，BCG)分泌的最主要的抗原蛋白。在人和小鼠體內(nèi)，Ag85B可明顯促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Th1分化，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗結(jié)核的保護(hù)性Th1型免疫反應(yīng)［7］。本課題組前期小鼠哮喘模型或哮喘患者體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ag85B DNA疫苗能增強(qiáng)Th1型免疫反應(yīng)，抑制Th2型免疫反應(yīng)，從而抑制哮喘氣道炎癥［8-9］，Ag85B慢病毒轉(zhuǎn)染正常人氣道上皮細(xì)胞可抑制其表達(dá)TSLP和TSLPR［10］。但Ag85B如何調(diào)控哮喘的作用機(jī)制仍不清楚，推測(cè)Ag85B可能通過抑制氣道上皮細(xì)胞釋放TSLP和改變起抗原提呈作用的樹突狀細(xì)胞的功能來調(diào)控哮喘Th2為主的氣道炎癥。

本研究首先體外誘導(dǎo)小鼠骨髓前體細(xì)胞分化為未成熟mDCs，并將經(jīng)免疫磁珠法純化后、倒置相差顯微鏡和電鏡形態(tài)證實(shí)以及流式細(xì)胞進(jìn)一步鑒定的mDCs作為研究靶細(xì)胞，運(yùn)用mDCs與Ag85B和TSLP共培養(yǎng)體系，以mDCs表面分子CD80和CD86、TSLPR和OX40L為研究切入點(diǎn)，探討Ag85B誘導(dǎo)mDCs的成熟以及對(duì)TSLP介導(dǎo)下的mDCs表達(dá)促炎表面分子TSLPR和OX40L的調(diào)節(jié)作用，研究Ag85B抑制哮喘氣道炎癥的分子調(diào)控機(jī)制。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康C57BL/6雌性小鼠，6～8周齡，20～25 g，均購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK(粵) 2013-0002。

2實(shí)驗(yàn)主要器材和試劑

超凈工作臺(tái)(蘇州安泰公司) ; CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、自動(dòng)洗板機(jī)(Thermo) ;磁珠純化儀(MiniMACS) ;流式細(xì)胞儀(BD) ;倒置相差顯微鏡(Nikon) ;掃描電鏡(Olympus)。

6孔培養(yǎng)板、RPMI-1640培養(yǎng)基(Corning) ;胎牛血清(Gibco) ;紅細(xì)胞裂解液(康為世紀(jì)) ;重組小鼠細(xì)胞因子rmIL-4、rmGM-CSF、抗小鼠流式抗體PEOX40L、APC-TSLPR、重組鼠TSLP蛋白(R＆D) ;小鼠CD11c磁珠抗體(MiniMACS) ; Ag85B蛋白(RayBiotech) ;抗小鼠流式抗體PE-CD11c、CD80、FITC-CD86 (eBioscience)。

3小鼠mDCs誘導(dǎo)培養(yǎng)和分離純化［11］

3.1小鼠mDCs的誘導(dǎo)培養(yǎng)處死小鼠，無菌分離股骨和脛骨，暴露骨髓腔，用RPMI-1640沖洗骨髓腔3～4次，將骨髓沖至50 mL離心管中，反復(fù)吹打均勻骨髓組織成細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心10 min;去上清液，加入紅細(xì)胞裂解液和生理鹽水，離心后細(xì)胞沉淀用RPMI-1640沖洗2遍，1 000 r/min離心10 min后收集細(xì)胞。50 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)液(含RPMI-1640、100 U青霉素、100 mg/L鏈霉素、10%胎牛血清、10 μg/L rmGM-SCF和10 μg/L rmIL-4)重懸收集的細(xì)胞，以2×106的濃度接種至6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL，37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)3 d，全量換液，除去未貼壁的淋巴細(xì)胞和細(xì)胞碎片，并補(bǔ)足細(xì)胞因子;以后隔天半量換液，培養(yǎng)至第7天后，輕輕吹打培養(yǎng)皿，收獲半懸浮細(xì)胞和疏松貼壁細(xì)胞待純化和鑒定。3.2小鼠mDCs的純化按磁珠抗體說明書操作步驟進(jìn)行。收集第7天的mDCs，按每108個(gè)細(xì)胞加入100 μL CD11c磁珠抗體，混勻4℃孵育15 min; 1 200 r/min離心10 min棄上清液，每108個(gè)細(xì)胞加入500 μL緩沖液重懸細(xì)胞;將重懸的細(xì)胞加入磁珠分選柱中，500 μL緩沖液洗滌分選柱3次，收集流下的未標(biāo)記細(xì)胞，最后向分選柱中加1 mL緩沖液，下壓活塞，收集標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞。

4小鼠mDCs的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定

4.1倒置相差顯微鏡觀察分別于培養(yǎng)48 h、第3、5、7天，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

4.2掃描電鏡觀察取培養(yǎng)第7天的mDCs，于多聚賴氨酸包被的細(xì)胞爬片上用2.5%戊二醛內(nèi)固定2 h，再依次乙醇梯度脫水、純丙酮置換乙醇、醋酸異戊酯置換丙酮，最后CO2臨界干燥、鍍膜、觀察。

4.3小鼠mDCs的流式細(xì)胞術(shù)鑒定分別收集培養(yǎng)第3、5、7天和純化后的mDCs，用PBS洗滌2次，重懸細(xì)胞為(1～2)×106，再用PBS洗滌3次，按使用說明書加入適宜工作濃度的抗小鼠樹突狀細(xì)胞表面分子的熒光抗體: PE-CD11c、CD80和FITC-CD86，避光4℃作用30 min，PBS洗滌3次，以熒光標(biāo)記的同型IgG作為對(duì)照，上機(jī)檢測(cè)CD11c、CD80和CD86的表達(dá)情況。

5 Ag85B和TSLP對(duì)小鼠mDCs表達(dá)共刺激分子CD80、CD86、OX40L和TSLPR的作用

為選擇適宜的Ag85B或TSLP的作用濃度，分別按0(空白對(duì)照組)、50、100以及200 μg/L的濃度處理純化鑒定后的mDCs，培養(yǎng)24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)mDCs表面CD80、CD86、OX40L和TSLPR的表達(dá)情況。

6 Ag85B對(duì)TSLP介導(dǎo)的mDCs表達(dá)TSLPR和OX40L的影響

選擇200 μg/L作為Ag85B和TSLP優(yōu)化處理濃度，將純化后的mDCs分為空白對(duì)照組、Ag85B處理組、TSLP處理組以及Ag85B+ TSLP處理組，培養(yǎng)24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)mDCs表面TSLPR和OX40L的表達(dá)。

7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1小鼠mDCs的形態(tài)特點(diǎn)

倒置相差顯微鏡觀察可見，培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)液中充滿了大量的骨髓原始細(xì)胞，多懸浮，部分貼壁;第3天貼壁細(xì)胞明顯增加，可見明顯細(xì)胞集落形成;第5天細(xì)胞集落逐漸懸浮，并可見細(xì)胞從集落邊緣分離; 第7天懸浮細(xì)胞大量增多，可見細(xì)胞突起，見圖1。掃描電鏡觀察可見細(xì)胞呈類圓形，表面粗糙，有少量皺褶和分叉的樹突狀突起，突起長(zhǎng)度短，較纖細(xì)，符合典型的mDCs的形態(tài)特征，見圖2。

Figure 1.Morphological characteristic of mouse mDCs at day 5 (×200) and day 7(×400).圖1培養(yǎng)第5天和第7天小鼠mDCs的形態(tài)學(xué)特征

Figure 2.The morphology of mouse mDCs under scanning electronic microscope at day 7.圖2培養(yǎng)第7天小鼠mDCs掃描電鏡下的形態(tài)學(xué)特征

2小鼠mDCs的流式細(xì)胞術(shù)鑒定

未純化前，體外培養(yǎng)第7天，CD11c+、CD80+、CD86+細(xì)胞表達(dá)比率均較第3天顯著增加(P＜0.05)，第5天CD11c+、CD80+細(xì)胞表達(dá)比率均較第3天顯著增加(P＜0.05)。結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，CD80+和CD86+細(xì)胞表達(dá)量雖然有所增加，但不如CD11c+細(xì)胞表達(dá)比率增加明顯，說明骨髓前體細(xì)胞逐漸向mDCs分化和增殖，處于高表達(dá)CD11c、低表達(dá)CD80和CD86的狀態(tài)。將培養(yǎng)第7天的細(xì)胞經(jīng)磁珠純化，富集后的CD11c+細(xì)胞表達(dá)比率為(90.78±5.79) %較未純化前的(65.60± 1.66) %顯著增高，前者是后者的1.4倍(P＜0.05)，而純化前后mDCs表達(dá)CD80、CD86的細(xì)胞比率相似，說明純化后的mDCs進(jìn)一步高表達(dá)CD11c，低表達(dá)CD80、CD86，此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的未成熟mDCs表型一致，見表1。

表1　不同培養(yǎng)時(shí)間小鼠mDCs特異性標(biāo)記物和共刺激分子的表達(dá)水平Table 1.The expression levels of specific marker and costimulatory molecules on the surface of mouse mDCs during different culture times (%.Mean±SD.n=5)

3Ag85B和TSLP對(duì)小鼠mDCs表達(dá)CD80、CD86、OX40L和TSLPR的作用

3.1Ag85B對(duì)mDCs表達(dá)共刺激分子CD80和CD86的作用50～200 μg/L的Ag85B刺激后，mDCs表達(dá)共刺激分子CD80和CD86的細(xì)胞比率均較空白對(duì)照組明顯增高(P＜0.05)，Ag85B的不同濃度處理組間CD80+細(xì)胞表達(dá)比率相似，無濃度依賴性變化。高濃度Ag85B(200 μg/L)處理組的CD86+細(xì)胞表達(dá)比率是低濃度(50 μg/L)處理組的1.5倍，差異顯著(P＜0.05)，CD86+細(xì)胞的表達(dá)比率顯示濃度依賴性增高的特點(diǎn)，見表2。表明Ag85B具有上調(diào)mDCs表面共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)，促進(jìn)mDCs成熟的作用。

3.2Ag85B對(duì)mDCs表達(dá)促炎表面分子TSLPR和OX40L的作用空白對(duì)照組和各濃度Ag85B處理組間TSLPR+和OX40L+細(xì)胞表達(dá)比率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2，表明單一的Ag85B刺激對(duì)mDCs促炎表面分子TSLPR和OX40L的表達(dá)無明顯作用。

表2　不同濃度Ag85B對(duì)小鼠mDCs的CD80、CD86、TSLPR和OX40L表達(dá)的影響Table 2.The effects of different concentrations of Ag85B on the expression of CD80，CD86，TSLPR and OX40L in the mouse mDCs (%.Mean±SD.n=3)

3.3TSLP對(duì)mDCs表達(dá)共刺激分子CD80和CD86的作用與空白對(duì)照組比較，50～200 μg/L的TSLP均可以上調(diào)mDCs的共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)比率(P＜0.05)，TSLP(200 μg/L)處理組CD80+細(xì)胞表達(dá)比率明顯高于其它2種濃度處理組(P＜0.05)，顯示出一定程度的濃度依賴性，但各處理組間CD86+細(xì)胞表達(dá)比率差異不顯著，無濃度依賴性變化，見表3，這表明TSLP具有上調(diào)mDCs表面共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)，促進(jìn)mDCs成熟的作用。

3.4TSLP對(duì)mDCs表達(dá)促炎表面分子TSLPR和 OX40L的作用與空白對(duì)照組和TSLP(50 μg/L)處理組相比較，100 μg/L和200 μg/L的TSLP處理組的TSLPR+和OX40L+細(xì)胞表達(dá)比率均增高1倍左右，差異顯著(P＜0.05)，而100 μg/L、200 μg/L兩處理組間TSLPR+和OX40L+細(xì)胞表達(dá)比率相似，見表3。這表明TSLP可以促進(jìn)mDCs促炎表面分子TSLPR和OX40L的表達(dá)，較低濃度時(shí)表達(dá)量隨著TSLP濃度遞增而增高，達(dá)100 μg/L濃度后不進(jìn)一步增高。

表3　不同濃度TSLP對(duì)小鼠mDCs的CD80、CD86、TSLPR和OX40L表達(dá)的影響Table 3.The effects of different concentrations of TSLP on the expression of CD80，CD86，TSLPR and OX40L in the mouse mDCs (%.Mean±SD.n=3)

4 Ag85B對(duì)TSLP介導(dǎo)下的mDCs表達(dá)促炎表面分子TSLPR和OX40L的影響

選擇200 μg/L作為Ag85B和TSLP的優(yōu)化處理濃度，觀察Ag85B、TSLP、Ag85B+ TSLP處理組及空白對(duì)照組的mDCs的促炎表面分子TSLPR和OX40L表達(dá)比率。TSLP組的TSLPR+和OX40L+細(xì)胞表達(dá)比率分別是(36.52±13.30) %和(43.96±4.60) %，顯著高于空白對(duì)照組，分別是空白對(duì)照組的2.1倍和2.8倍(P＜0.05)。Ag85B處理組、Ag85B+ TSLP處理組的TSLPR+和OX40L+細(xì)胞表達(dá)比率顯著低于TSLP組(P＜0.05)，并與空白對(duì)照組的陽(yáng)性表達(dá)比率相似。結(jié)果表明Ag85B可能對(duì)TSLP介導(dǎo)的mDCs表達(dá)促炎表面分子TSLPR和OX40L具有抑制作用，見圖3、表4。

討論

目前體外誘導(dǎo)DCs擴(kuò)增多采用聯(lián)合細(xì)胞因子刺激樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞增殖的方法，前體細(xì)胞主要來自骨髓、臍帶血等，GM-CSF和IL-4是最常用的聯(lián)合細(xì)胞因子，在DCs的體外擴(kuò)增中發(fā)揮重要作用。GM-CSF是DCs體外擴(kuò)增最重要的細(xì)胞因子，它不僅能誘導(dǎo)前體細(xì)胞形成集落向樹突狀細(xì)胞分化，而且能夠延長(zhǎng)樹突狀細(xì)胞的壽命。IL-4能抑制培養(yǎng)細(xì)胞中中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生，并維持DCs處于未成熟狀態(tài)。因此，GM-CSF聯(lián)合IL-4共同刺激骨髓前體細(xì)胞，可以使其在體外定向誘導(dǎo)成mDCs，既提高細(xì)胞產(chǎn)量，又保持細(xì)胞處于未成熟的特點(diǎn)。本研究參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法［11］，利用rmGM-CSF(10 μg/L)和rmIL-4(10 μg/L)聯(lián)合細(xì)胞因子共同刺激小鼠骨髓前體細(xì)胞，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)和體外擴(kuò)增mDCs，再采用免疫磁珠對(duì)mDCs進(jìn)行純化，進(jìn)一步增加細(xì)胞的純度。接著，為進(jìn)一步保證分離純化的mDCs是未成熟的mDCs，本課題組對(duì)純化后的mDCs進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和細(xì)胞表型的進(jìn)一步鑒定。掃描電鏡下細(xì)胞呈類圓形，表面粗糙似云霧狀，有少量皺褶和分叉的樹突狀突起，符合未成熟mDCs的形態(tài)特征［12］;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分離純化的mDCs的細(xì)胞表型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過7 d培養(yǎng)，每只小鼠骨髓細(xì)胞可獲得1～2×107個(gè)mDCs，經(jīng)免疫磁珠純化后，細(xì)胞表達(dá)特異性的標(biāo)記物CD11c的細(xì)胞比率高達(dá)90%，呈現(xiàn)高水平表達(dá)CD11c，低水平表達(dá)表面共刺激分子CD80、CD86的特點(diǎn)，與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的未成熟mDCs表型特征一致［13-14］。本實(shí)驗(yàn)體外成功誘導(dǎo)出高產(chǎn)量、高純度的未成熟mDCs，為后續(xù)mDCs的免疫、生物功能學(xué)研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

研究證實(shí)未成熟mDCs具有很強(qiáng)的吞噬、加工處理抗原的能力，表面低表達(dá)CD80、CD86等共刺激分子，捕獲抗原后，在一些活化因子如脂多糖、TNF-α等作用下可分化為成熟mDCs，其表面共刺激分子的表達(dá)也會(huì)顯著上調(diào)［15］。

Figure 3.The effects of Ag85B on the expression of OX40L and TSLPR in TSLP-mediated mDCs.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs TSLP group.圖3 Ag85B對(duì)TSLP介導(dǎo)下mDCs表達(dá)TSLPR和OX40L的影響

本研究應(yīng)用不同梯度濃度的重組鼠TSLP蛋白，探討優(yōu)化TSLP作用濃度，從中研究TSLP對(duì)鼠源性未成熟mDCs的作用。既往研究證實(shí)TSLP介導(dǎo)的mDCs在誘導(dǎo)哮喘Th2型炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，首先，TSLP作用于mDCs表面受體TSLPR，可促進(jìn)其成熟，上調(diào)表達(dá)CD80和CD86［16］;其次，TSLP促進(jìn)mDCs表面表達(dá)OX40L，后者與初始CD4+T細(xì)胞表面的OX40相互結(jié)合，促使初始CD4+T細(xì)胞分化成Th2細(xì)胞并分泌Th2型細(xì)胞因子，導(dǎo)致哮喘嗜酸性細(xì)胞為主的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)［17］。目前，Yokoi等［18］用15 μg/L濃度的TSLP可刺激培養(yǎng)健康人外周血分離出mDCs成熟，未見關(guān)于TSLP與鼠源mDCs的相關(guān)研究。由于本實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞為鼠源的mDCs，考慮到種屬的差異性，故采用相對(duì)較高的作用濃度來培養(yǎng)24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50 μg/L、100 μg/L和200 μg/L的TSLP濃度均可以上調(diào)mDCs表達(dá)CD80和CD86。而進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度的TSLP(100 μg/L和200 μg/L)可以上調(diào)mDCs表達(dá)促炎分子TSLPR和OX40L。這些結(jié)果說明TSLP可以通過上調(diào)mDCs表面的共刺激分子CD80、CD86表達(dá)，促進(jìn)mDCs進(jìn)一步成熟。TSLP活化后的mDCs上調(diào)表達(dá)OX40L，這為mDCs與初始CD4+T細(xì)胞表面的OX40相互作用促進(jìn)后者向Th2分化奠定了基礎(chǔ);同時(shí)TSLP還可以促進(jìn)mDCs表達(dá)TSLPR，進(jìn)一步放大了TSLP對(duì)mDCs的成熟和活化的驅(qū)動(dòng)作用。值得注意的是，雖然擁有相同的配體CTLA4/CD28，但CD80和CD86的作用機(jī)制卻存在差異性，研究表明APC細(xì)胞的表面共刺激分子CD80主要刺激初始CD4+T細(xì)胞向Th1分化，而CD86刺激初始CD4+T細(xì)胞向Th2分化。CD86單克隆抗體可以降低哮喘小鼠Th2型細(xì)胞因子水平，升高Th1型細(xì)胞因子水平，使失調(diào)的Th1/Th2平衡得到糾正［19］。CD80 DNA疫苗可以提高哮喘小鼠的肺泡灌洗液中和脾淋巴細(xì)胞Th1/Th2比例，從而抑制哮喘氣道炎癥［20］。從既往研究和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，TSLP既可促進(jìn)mDCs表達(dá)共刺激分子CD80和CD86促進(jìn)其成熟，又可以促進(jìn)mDCs表達(dá)促炎分子TSLPR和OX40L，提示TSLP可介導(dǎo)mDCs的成熟、活化，并加強(qiáng)了其與下游的初始CD4+T淋巴細(xì)胞的炎癥級(jí)聯(lián)效應(yīng)和免疫效應(yīng)，其作用是通過上調(diào)mDCs共刺激信號(hào)和表面促炎分子的共同表達(dá)，誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞向Th2分化。

表4　Ag85B對(duì)TSLP介導(dǎo)下mDCs表達(dá)TSLPR和OX40L的影響Table 4.The effects of Ag85B (200 μg/L) on the expression of TSLPR and OX40L in TSLP (200 μg/L) -mediated mDCs (%.Mean±SD.n=5)

研究發(fā)現(xiàn)，BCG對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性哮喘具有預(yù)防性治療作用［21］，而Ag85B在哮喘抗炎作用也愈受重視。在小鼠哮喘模型中，不論是采用經(jīng)鼻滴入或經(jīng)腹腔注射Ag85B DNA疫苗，還是腹腔注射重組Ag85B，均可抑制哮喘小鼠以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的肺部炎癥，并伴隨氣道Th2型免疫應(yīng)答下調(diào)，Th1型免疫應(yīng)答上調(diào)［9，22-23］。但Ag85B的這種免疫調(diào)節(jié)作用的具體機(jī)制仍不清楚。本課題組前期將Ag85B慢病毒轉(zhuǎn)入正常人氣道上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Ag85B慢病毒感染氣道上皮細(xì)胞可抑制其表達(dá)TSLP和TSLPR［10］，故推測(cè)Ag85B可能通過調(diào)節(jié)炎癥啟動(dòng)的上游環(huán)節(jié)如氣道上皮細(xì)胞或起抗原遞呈、處理作用的mDCs，而調(diào)控下游炎癥主要的效應(yīng)細(xì)胞初始CD4+T細(xì)胞的分化。國(guó)外有報(bào)道稱BCG可以上調(diào)mDCs表達(dá)CD80和CD86促進(jìn)其成熟［18，24］，Ag85B作為BCG最主要分泌的蛋白，也是一種抗原蛋白，因此可能同樣具有促進(jìn)mDCs成熟的功能。本實(shí)驗(yàn)為了探討Ag85B對(duì)mDCs作用，采用同選擇TSLP對(duì)mDCs作用濃度相似的思路摸索Ag85B的作用濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各濃度的Ag85B也可以上調(diào)mDCs表達(dá)共刺激分子CD80和CD86，促進(jìn)mDCs成熟，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組和各濃度Ag85B處理組間TSLPR 和OX40L的表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明單一的Ag85B雖然也具有類似TSLP的刺激mDCs表達(dá)共刺激分子CD80、CD86的作用，也能促進(jìn)未成熟mDCs成熟，但單一Ag85B對(duì)促炎分子TSLPR和OX40L表達(dá)影響甚微，與TSLP促進(jìn)mDCs表達(dá)促炎分子TSLPR和OX40L不同，這提示Ag85B促進(jìn)的mDCs成熟，不利于Th2免疫反應(yīng)的發(fā)生，無明顯加重哮喘的慢性氣道炎癥過程。

為了探討Ag85B對(duì)TSLP介導(dǎo)下mDCs表達(dá)TSLPR和OX40L是否有影響，我們又進(jìn)一步設(shè)計(jì)了Ag85B和TSLP聯(lián)合處理mDCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSLP處理組的mDCs其TSLPR和OX40L的表達(dá)明顯增高，而Ag85B+ TSLP處理組的mDCs其TSLPR和OX40L的表達(dá)明顯降低至基本與空白對(duì)照組和單獨(dú)Ag85B處理組相似的水平，結(jié)合50～200 μg/L各濃度梯度的單獨(dú)Ag85B處理組的mDCs其TSLPR和OX40L的表達(dá)無顯著差異，推測(cè)Ag85B具有TSLP依賴性地抑制mDCs表達(dá)TSLPR和OX40L的作用，而在無TSLP刺激下，對(duì)mDCs表達(dá)TSLPR和OX40L的作用甚微，從一定程度上表明Ag85B具有體外抑制炎癥介質(zhì)TSLP介導(dǎo)的、以TSLPR和OX40L為作用靶點(diǎn)的、樹突狀細(xì)胞與下游的CD4+T淋巴細(xì)胞共同參與的氣道炎癥和Th2免疫反應(yīng)的可能性。

本實(shí)驗(yàn)仍存在一定的缺陷和局限性。Ag85B和TSLP的作用濃度為本實(shí)驗(yàn)條件下的摸索濃度，不同實(shí)驗(yàn)條件下可能存在一定的差異;在本實(shí)驗(yàn)中單用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了TSLPR和OX40L的表達(dá)，還可以進(jìn)一步結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和蛋白免疫印跡法等實(shí)驗(yàn)技術(shù)來檢測(cè)TSLPR和OX40L的表達(dá);實(shí)驗(yàn)所得出的結(jié)論均是基于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，仍需要進(jìn)一步在動(dòng)物模型(哮喘模型)中驗(yàn)證。

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(責(zé)任編輯:林白霜，余小慧)

Ag85B regulates myeloid dendritic cell maturation and suppresses expression of TSLPR and OX40L mediated by TSLP in vitro

QIAN Jiang1，2，WU Jian2，AN Hong1，2，F(xiàn)ANG Xiang-feng1，2，LI Dong-feng3，YANG Shi-fang2，MENG Jin-xiu3，GAO Xing-lin2
(1Graduate School of Southern Medical University，Guangzhou 510515，China;2Department of Respiratory Medicine，3Medical Research Center，Guangdong General Hospital，Guangdong Provincial Institute of Geriatrics and Guangdong Academy of Medical Sciences，Guangzhou 510080，China.E-mail: wjxst@hotmail.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the maturation of mice immature myeloid dendritic cells (mDCs) induced by antigen(Ag) 85B of mycobacterium tuberculosis，and the expression of TSLPR and OX40L mediated by TSLP in vitro.METHODS: Recombinant mouse GM-CSF (rmGM-CSF) and rmIL-4 were used to induce bone marrow precursor cells of C57BL/6 mice to differentiate into immature mDCs in vitro.mDCs were identified followed by purification using CD11c binding magnetic beads.The morphological characteristic of mDCs was observed under inverted phase-contrast microscopebook=1681,ebook=153and scanning electron microscope.The surface phenotypes of mDCs were determined by flow cytometry.To obtain the optimal concentrations of Ag85B and TSLP，immature mDCs were cultured with different concentrations of Ag85B or TSLP at 0 (control group)，50，100 and 200 μg/L for 24 h，and the expression of cell surface molecules CD80，CD86，TSLPR and OX40L was detected by flow cytometry.In addition，the expression of TSLPR and OX40L in Ag85B and TSLP-co-stimulated mDCs was determined by flow cytometry.RESULTS: After 7 d of culture in vitro，the cells showed irregular dendritic protrusions under the inverted-phase contrast microscope，and had wrinkles and dendritic splits under scanning electron microscope，conformed to the morphological characteristics of immature mDCs.The mDCs cells expressed higher level of specific marker CD11c，lower level of co-stimulatory molecules CD80 and CD86，which conformed to the phenotype of immature mDCs.The CD80+and CD86+cell ratios of mDCs displayed significant increases in 50，100 and 200 μg/L Ag85B or TSLP groups compared with control group (P＜0.05).The ratios of TSLPR+and OX40L+cells did not differ among different concentrations of Ag85B groups.The ratios of TSLPR+and OX40L+cells were significantly increased in 100 μg/L and 200 μg/L TSLP groups compared with control group and 50 μg/L TSLP group (P＜0.05).Under the circumstance of optimal Ag85B or TSLP treatment concentration at 200 μg/L，there was significantly decreased in TSLPR and OX40L cell ratio of mDCs in Ag85B group or Ag85B combined with TSLP group when compared with TSLP group (P＜0.05)，and no significant difference among Ag85B group，Ag85B combined with TSLP group and control group was observed.CONCLUSION: Ag85B enhances mDCs maturation by up-regulating the expression of co-stimulatory molecules CD80 and CD86，and inhibit the expression of pro-inflammatory specific molecules TSLPR and OX40L on TSLP-activated mDCs，indicating that Ag85B modifies the development of asthmatic airway inflammation through the pathway of TSLP-activated mDCs.

［KEY WORDS］Antigen 85B; Thymic stromal lymphopoietin; Myeloid dendritic cells; Thymic stromal lymphopoietin receptor; OX40L

通訊作者△Tel: 020-83827812; E-mail: wjxst@hotmail.com

*［基金項(xiàng)目］廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2014J4100040) ;廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.S2011010003664) ;廣州市健康醫(yī)療協(xié)同創(chuàng)新重大專項(xiàng)基金(No.201400000002) ;廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2013B031800026)

［收稿日期］2015-05-07

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)09-1680-08

［中圖分類號(hào)］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.027