石鵬　曹紅星　李東霞　王永　雷新濤

摘 要 油棕果實中含有豐富的維生素E，而提高其中高活性的維生素E組分是改善棕油品質(zhì)的關(guān)鍵。油棕γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶（GenBank登錄號為AEU17779）能將低活性的γ-生育酚三烯催化生成高活性的α-生育酚和α-生育酚三烯，是控制油棕維生素E組分和活性的關(guān)鍵酶，其功能在油棕等許多植物中極其保守。本研究利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對以油棕VTE4基因為主要分析對象的一些植物VTE4基因的核酸和相應(yīng)的氨基酸序列的組成成分、疏水性/親水性、跨膜結(jié)構(gòu)域以及功能結(jié)構(gòu)域等進行分析。結(jié)果表明：VTE4屬于不具有信號肽的親水性蛋白，可能作為轉(zhuǎn)運蛋白在葉綠體中發(fā)揮作用，α-螺旋和無規(guī)則卷曲大量散布于整個蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，具有S-腺苷甲硫氨酸結(jié)合位點和PLN02244保守結(jié)構(gòu)域。這一結(jié)果可為油棕等植物VTE4的功能和分子機制研究提供更多詳細(xì)的參考。

關(guān)鍵詞 油棕；γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶；生物信息學(xué)；保守結(jié)構(gòu)域

中圖分類號 Q811.4 文獻標(biāo)識碼 A

油棕（Elaeis guineensis Jacq.）屬棕櫚科油棕屬多年生喬木，是重要的熱帶木本油料作物，生產(chǎn)效率很高，有“世界油王”之稱。維生素E在油棕果實中的含量大約為100 mg/kg，其作為功能性成分影響著棕油的品質(zhì)，粗棕油中的維生素E類主要是γ-生育酚三烯、α-生育酚和α-生育酚三烯[1]。低活性的γ-生育酚三烯會影響人體的吸收利用，VTE4能將γ-生育酚三烯催化生成高活性的α-生育酚和α-生育酚三烯。因此，對油棕等植物的VTE4的生物信息學(xué)分析對于油棕維生素E品質(zhì)性狀的改良具有十分重要的意義。

維生素E是一類脂溶性物質(zhì)，通常在光合作用器官中合成和積累，是人們飲食中攝取的重要成分。植物中合成的維生素E是生育酚和生育酚三烯的總稱，按照側(cè)鏈基團是否飽和分為生育酚（tocopherol）和生育酚三烯（tocotrienol），又根據(jù)苯環(huán)上甲基位置和數(shù)目的不同各分為α、β、γ和δ共4種類型[2]。盡管所有的維生素E組分都有生物活性，但是α-生育酚/生育酚三烯的活性是其它種類的2～50倍，主要是因為哺乳動物肝臟中含有α-生育酚/生育酚三烯的轉(zhuǎn)運蛋白[3]。維生素E不僅對提高植物自身的抗光氧化、抗寒、抗旱和抗鹽堿等非生物逆境脅迫有重要作用，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面也發(fā)揮重要作用[4-7]。此外，維生素E能增強人類免疫力、減緩衰老、抑制心血管疾病和癌癥的發(fā)生[8-11]。維生素E在植物中合成時首先在一系列酶的催化下生成γ和δ類型的生育酚及生育酚三烯，隨后都在VTE4（γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶，γ-TMT，γ-tocopherol methyltransferase）的催化下分別生成α和β類型的生育酚及生育酚三烯[12]。而α和β類型的維生素E的活性較高，所以說VTE4是決定植物中維生素E成分和活性的關(guān)鍵酶，其基因已經(jīng)在多種植物中被克隆和研究。Li等[13]在擬南芥中使VTE4過量表達時， 可使擬南芥葉片維生素E中α-生育酚比率從87.5%增加到97.1%。Jessica等[14]在甘藍(lán)型油菜中克隆并定位了4個與擬南芥VTE4同源的基因，轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)其中的一個拷貝BnaA.VTE4.a1能夠提高α-生育酚的含量。Maria等[15]在大豆中通過QTL定位分析找到了一個γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因，對γ-TMT3分析發(fā)現(xiàn)它的變異位點決定著大豆種子中α-生育酚的含量。Yusuf等[16]在芥菜型油菜超表達VTE4使α-生育酚含量提高了6倍。

生物信息學(xué)是應(yīng)用信息學(xué)技術(shù)（來自于應(yīng)用數(shù)學(xué)、計算機科學(xué)和統(tǒng)計學(xué)）大規(guī)模解析和組織與這些分子（核酸和氨基酸等）相關(guān)的信息。簡而言之，生物信息學(xué)是分子生物學(xué)的一種管理信息系統(tǒng)，有大量的實際應(yīng)用價值。利用互聯(lián)網(wǎng)上的各種分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫及軟件對已知的核酸和氨基酸序列進行比對、分析及建立計算模型，對其結(jié)構(gòu)和功能進行預(yù)測與分析，是生物信息學(xué)的重要分析思路[17-18]。許多植物中都開展了VTE4基因的生物信息學(xué)分析，但是在油棕中還少有報道。本文應(yīng)用生物信息學(xué)的方法以油棕VTE4基因為主要分析對象，對來自GenBank（美國國家生物技術(shù)信息中心遺傳序列數(shù)據(jù)庫）中的油棕等不同植物的VTE4基因的核酸及氨基酸序列的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征和功能特征等進行預(yù)測和分析，為油棕等植物VTE4基因的進一步研究提供更詳細(xì)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

數(shù)據(jù)資料均來源于NCBI（National Center for Biotechnology Information）的核酸及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中已有的油棕等植物γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因的核酸序列及其對應(yīng)的氨基酸序列：油棕（Elaeis guineensis，JN848783、AEU17779）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，NM105171、AAM64696）、小麥（Triticum aestivum，DQ139266、CAI77219）、玉米（Zea mays，NM001112444、AGF92707）、馬鈴薯（Solanum tuberosum，DQ456877、ABE41795）；另外構(gòu)建系統(tǒng)進化樹還用到了一下幾種植物的VTE4氨基酸序列：美洲油棕（E. oleifera，ABS76142）、野生番茄（S. pennellii，ADZ24710）、可可（Theobroma cacao，EOY10208）、栽培番茄（S. lycopersicum，NP001233814）、白蘇（Perilla frutescens，AEP68180）、陸地棉（Gossypium hirsutum，ABE41798）。

1.2 方法

利用NCBI（http：//www.ncbi.hlm.nih.gov/）、CBS（http：//www.cbs.dtu.dk）和ExPASy（www.expasy.ch）等網(wǎng)站提供的在線生物信息學(xué)工具和MEGA 6.06序列比對分析軟件（http：//www.megasoftware.net/）進行分析。核酸及氨基酸序列的組成成分和理化性質(zhì)的分析、開放閱讀框（ORF，Open reading frame）的查找和翻譯利用NCBI上的ORF Finder和ExPASy上的ProtParam在線工具；核酸及氨基酸序列的同源性比對和分子進化樹聚類利用Clustal Omega在線工具和MEGA 6.06軟件分析；氨基酸翻譯后修飾、蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域、親水/疏水性及亞細(xì)胞定位的分析利用在線工具NetPhos 2.0 Server、TMHMM 2.0 Server、ProtScale和PSORT完成；蛋白質(zhì)信號肽和導(dǎo)肽預(yù)測利用在線工具SignalP 4.1 Server和TargetP1.1 Server。蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測利用NCBI上的CDD在線工具完成，蛋白質(zhì)二級及三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測利用SOPMA和SWISS-MODEL在線工具完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 油棕等植物VTE4基因核酸及氨基酸序列分析

利用NCBI上的ORF Finder和ExPASy上的ProtParam對油棕、擬南芥、小麥、玉米和馬鈴薯5種植物的VTE4基因的核酸序列及其氨基酸序列進行分析。分析結(jié)果如表1所示，ORF Finder分析發(fā)現(xiàn)不同植物VTE4基因開放閱讀框的堿基數(shù)及所推導(dǎo)的氨基酸殘基數(shù)相差不大，起始密碼子均為ATG，終止密碼除擬南芥為TAA外，其它4種植物均為TAG 。利用ProtParam分析氨基酸理化性質(zhì)發(fā)現(xiàn)不同植物γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白的分子量和理論等電點基本一致；Ala、Ser、Leu、Gly、Arg、Lys、Pro、Ile是這5種植物γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶中含量最豐富的氨基酸；由于不穩(wěn)定性指數(shù)小于40才是穩(wěn)定類蛋白質(zhì)，所以它們都屬于不穩(wěn)定類蛋白質(zhì)，且親水系數(shù)都為負(fù)值，都為親水性蛋白質(zhì)，可能不會作為膜蛋白行使功能。

2.2 油棕等植物VTE4親水性/疏水性的預(yù)測和分析

利用ProtScale在線工具對油棕VTE4氨基酸序列的疏水性/親水性進行預(yù)測（圖1）。結(jié)果表明，多肽鏈第47位的Ser具有最低的分值-2.711，親水性最強；而第337位的Ile具有最高的分值2.478，疏水性最強。整體來看，親水氨基酸數(shù)量大于疏水氨基酸，故推測油棕γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)為親水性蛋白。小麥和擬南芥等其它植物γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列的疏水性/親水性分析結(jié)果與此基本一致，即γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶多肽鏈表現(xiàn)為親水性，據(jù)此可以推斷植物γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶是親水性蛋白質(zhì)。

2.3 油棕等植物VTE4二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分析

利用在線二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件SOPMA對油棕VTE4氨基酸序列進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（圖2）。結(jié)果表明，油棕VTE4氨基酸二級結(jié)構(gòu)由48.4%的α-螺旋（Alpha helix），35.28%的無規(guī)則卷曲（Random coil），11.37%的延伸鏈（Extended strand）和4.96%β-轉(zhuǎn)角（Beta turn）組成。在VTE4蛋白的整體結(jié)構(gòu)中，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是油棕VTE4最主要的結(jié)構(gòu)元件，而延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角則分布于整個蛋白質(zhì)中。其它植物的VTE4氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與此基本一致。據(jù)此可以推測在植物γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是最豐富的結(jié)構(gòu)元件，而延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角則分散其中。

2.4 油棕等植物VTE4蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分析

利用SWISS-MODEL在線工具預(yù)測油棕VTE4蛋白的三級結(jié)構(gòu)，通過同源建模的方法獲得油棕VTE4三維結(jié)構(gòu)模式（圖3）。建模發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)模板2o57.1.A有較高相似性，達到21.90%。圖中藍(lán)色螺旋環(huán)即為α-螺旋，它在油棕γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶中占據(jù)主要部分，且根據(jù)三級結(jié)構(gòu)特征推測為肌氨酸二甲基甘氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（sarcosine dimethylglycine methyltransferase，SDMT）。小麥和擬南芥等其它植物的γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測和分析結(jié)果基本一致。

2.5 油棕等植物VTE4跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測和分析

跨膜結(jié)構(gòu)域是穿過細(xì)胞膜連接細(xì)胞內(nèi)外的部分，主要功能是固定蛋白質(zhì)，另外還有一些具有介導(dǎo)細(xì)胞信號傳遞的功能。對蛋白質(zhì)進行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測，可以判斷蛋白質(zhì)是否定位在細(xì)胞膜上，具有介導(dǎo)細(xì)胞信號傳遞功能。利用在線工具TMHMM對油棕VTE4氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域。小麥和擬南芥等其它植物跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果基本一致，表明植物γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，可能不是固定在細(xì)胞膜上，而是轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)。

2.6 油棕等植物VTE4翻譯后修飾的預(yù)測和分析

翻譯后修飾是蛋白質(zhì)在翻譯后進行的化學(xué)修飾，這是大部分蛋白質(zhì)生物合成的較后步驟。對蛋白質(zhì)修飾是控制蛋白質(zhì)活性的一種機制，常見的修飾有磷酸化、甲基化和乙?；?，對蛋白質(zhì)的翻譯后修飾預(yù)測分析對正確認(rèn)識和理解蛋白質(zhì)的功能具有重要作用。利用NetPhos 2.0 Server在線工具對油棕VTE4的翻譯后修飾預(yù)測的結(jié)果表明（圖4），油棕γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶多肽鏈中的磷酸化位點（分值>0.5）有16個，其中Ser（絲氨酸）：12，Thr（蘇氨酸）：3，Tyr（酪氨酸）：1。小麥和擬南芥等其它植物的磷酸化位點預(yù)測結(jié)果與此基本一致。

2.7 油棕等植物VTE4的亞細(xì)胞定位分析

亞細(xì)胞定位可以預(yù)測蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的具體存在部位，例如在細(xì)胞核內(nèi)、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或者細(xì)胞器中存在。利用PSORT在線工具對油棕等5種植物的VTE4蛋白質(zhì)進行亞細(xì)胞定位分析（表2），結(jié)果表明，油棕和小麥VTE4蛋白質(zhì)分別定位在細(xì)胞核和線粒體基質(zhì)的可能性最大，擬南芥、玉米和馬鈴薯則主要定位在葉綠體基質(zhì)中，據(jù)結(jié)果推測植物γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白可能主要是在葉綠體中行使功能。

2.8 油棕等植物VTE4信號肽和導(dǎo)肽的預(yù)測和分析

信號肽是新合成肽鏈中用來引導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜定位的氨基酸序列，一般位于蛋白質(zhì)N端，有15～30個氨基酸，包括中間疏水區(qū)、C端加工區(qū)和堿性氨基酸N端等3部分。利用在線工具SignalP 4.1 Server對油棕VTE4氨基酸序列的信號肽進行預(yù)測（圖5），結(jié)果表明，油棕VTE4不含有信號肽。對其它幾種植物VTE4氨基酸序列的存在位置及其序列做相應(yīng)的分析也得到了與之相一致的結(jié)果，即植物γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶不存在信號肽。

導(dǎo)肽是新合成蛋白質(zhì)N端大約20～80個氨基酸的肽鏈，主要功能是引導(dǎo)蛋白質(zhì)穿過線粒體等細(xì)胞器雙層膜，運送蛋白質(zhì)。利用TargetP1.1 Server進行導(dǎo)肽分析也證實了其作為葉綠體轉(zhuǎn)運蛋白（分值為0.876）和線粒體轉(zhuǎn)運蛋白（分值為0.507）的可能性比較大，該蛋白存在信號肽（分值為0.003）的可能性很小。此結(jié)果與亞細(xì)胞定位和信號肽預(yù)測結(jié)果基本一致。

2.9 油棕等植物VTE4保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測和分析

結(jié)構(gòu)域?qū)嵸|(zhì)上是二級結(jié)構(gòu)的組合體，充當(dāng)三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，每個結(jié)構(gòu)域分別代表一種功能。利用NCBI中的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（Conserved Domain Database，CDD）工具對VTE4基因的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶含有S-adenosylmethionine（SAM，S-腺苷甲硫氨酸）結(jié)合位點，AdoMet_MTases（腺苷甲硫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶）保守域，AdoMet_MTases superfamily家族和PLN02244保守結(jié)構(gòu)域。其中PLN02244是生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的特征序列（圖6）。

2.10 油棕等植物VTE4氨基酸序列比對及分子系統(tǒng)進化分析

用Blast程序比對油棕與其它植物VTE4的核酸及氨基酸序列同源性，結(jié)果表明油棕VTE4的核酸序列與其它植物如水稻（NM001054379）、大麥（AK369125）、小麥（DQ139266）、葡萄（FQ394048）、陸地棉（DQ456880）、大豆（NM001249796）、白蘇（JN381069）和萵苣（FJ975047）的一致性分別是76%、75%、75%、75%、74%、74%、74%、74%；蛋白質(zhì)的Blastp比對結(jié)果，油棕VTE4的氨基酸序列與其他植物的氨基酸序列有基本一致的相似性，如與栽培番茄（NP001233814）、可可（EOY10208）、山羊草（EMT29211）、白蘇（AEP68180）、陸地棉（ABE41798）、馬鈴薯（ABE41795）、玉米（AGF92707）和小麥（CAI177219）的一致性分別為78%、77%、76%、75%、75%、73%、72%、71%。據(jù)此可以發(fā)現(xiàn)，不同植物VTE4的氨基酸序列之間的相似性與核酸之間的相似性基本一致。根據(jù)以上Blast結(jié)果，用EBI（歐洲生物信息學(xué)研究所）上的Clustal Omega程序?qū)τ妥?、擬南芥、馬鈴薯、小麥和玉米5種植物的VTE4氨基酸序列進行多序列比對，其結(jié)果顯示，不同植物γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的功能域是很保守的。

將11個源自不同物種的VTE4氨基酸序列用MEGA 6.06軟件進行分子系統(tǒng)進化分析，采用Neighbor-Joining法，進行1 000次bootstrap統(tǒng)計學(xué)檢驗構(gòu)建分子進化樹（圖7）。結(jié)果表明，11種不同植物的VTE4氨基酸序列聚成4支，擬南芥和白蘇各自成一支；可可和陸地棉聚成一支；非洲油棕、美洲油棕、小麥、玉米、馬鈴薯、野生番茄和栽培番茄聚成一支。由此可見，依據(jù)氨基酸序列構(gòu)建的分子進化樹能比較真實地反映不同物種之間的系統(tǒng)分類學(xué)關(guān)系和自然演化進程，對明確判斷物種間的親緣關(guān)系具有一定的參考價值。

3 討論與結(jié)論

γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶最早是從擬南芥中克隆的，是催化低活性的γ-生育酚/生育酚三烯和δ-生育酚/生育酚三烯生成高生物活性的α-生育酚/生育酚三烯和β-生育酚/生育酚三烯的關(guān)鍵酶[19]。而維生素E這些組分的變化影響其活性的高低，VTE4是控制植物維生素E組分和活性的重要基因，通過對油棕等植物γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的生物信息學(xué)分析，有助于加深對VTE4的生物學(xué)功能的了解。油棕果實中含有豐富的維生素E，維生素E是一種功能性成分，不僅能提高植物本身的抗逆性，而且對于保護人體健康具有重要意義。維生素E的組分和活性直接決定著棕油的品質(zhì)，增加高活性的α-生育酚/生育酚三烯和β-生育酚/生育酚三烯的含量是關(guān)鍵。利用生物信息學(xué)工具對油棕VTE4這一關(guān)鍵基因進行結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測有助于了解油棕維生素E合成的分子機制，為下一步的VTE4基因功能分析和遺傳改良奠定基礎(chǔ)。利用油棕VTE4基因序列開發(fā)特異分子標(biāo)記，可以用于油棕種質(zhì)資源鑒定和評價，為后續(xù)雜交育種親本選擇奠定基礎(chǔ)。而且未來可以利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，直接改良優(yōu)良種質(zhì)資源的維生素E組分，提高棕油品質(zhì)。

擬南芥中γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶研究表明，VTE4蛋白質(zhì)與Δ-24-甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶（Δ-24-sterol-C-methyltransferases）有類似的氨基酸序列，VTE4蛋白質(zhì)包含有SAM結(jié)合域和N端信號肽等γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)特點[6]。本研究通過利用生物信息學(xué)的相關(guān)工具對油棕等5種植物的VTE4基因的核酸及氨基酸序列的組成、生化特性、結(jié)構(gòu)特點和功能等進行了預(yù)測和分析，并對油棕等11種植物的VTE4氨基酸序列進行了分子進化樹聚類分析。預(yù)測結(jié)果表明，不同植物VTE4基因推測的氨基酸序列的理化性質(zhì)相差不大，且都屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。膜結(jié)構(gòu)域、信號肽及導(dǎo)肽預(yù)測表明，5種植物的VTE4都沒有發(fā)現(xiàn)明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽，但是可能作為葉綠體轉(zhuǎn)運蛋白行使功能。據(jù)此可以推斷VTE4基因在游離核糖體上起始合成后，可能轉(zhuǎn)運到葉綠體中發(fā)揮作用，與Ferro等[20]研究結(jié)果一致。通過NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫對VTE4基因的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶均含有S-腺苷甲硫氨酸結(jié)合位點、AdoMet_

MTases保守域、AdoMet_MTases superfamily家族和PLN02244保守結(jié)構(gòu)域，其中PLN02244保守結(jié)構(gòu)域是γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的特征結(jié)構(gòu)域。這些預(yù)測結(jié)果與花生、紫花苜蓿和大豆VTE4的研究結(jié)果基本一致[18，21-22]。油棕等11種植物VTE4氨基酸序列比對和分子進化樹聚類分析發(fā)現(xiàn)，不同植物的VTE4序列相似性高，其功能域非常保守，而以VTE4氨基酸序列構(gòu)建的進化樹對判斷物種間的親緣關(guān)系具有參考作用。油棕等植物VTE4的氨基酸序列分析可以作為判斷不同物種間親緣關(guān)系的依據(jù)，例如可以用來判斷油棕種間親緣關(guān)系，進行油棕種間進化分析。通過對油棕等不同植物的γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶進行生物信息學(xué)預(yù)測和分析，豐富了油棕等植物的分子生物學(xué)信息，為今后深入研究和利用油棕等植物的VTE4基因奠定了基礎(chǔ)。

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