王建超　王卿　施文昊　祁芳斌　陳發(fā)興

摘 要 以枇杷葉為試材，在單因素試驗基礎上，采用響應面分析法，建立料液比、乙醇濃度、提取溫度和提取時間等4個因素影響枇杷葉多酚提取率的二次多項回歸模型，并驗證該數(shù)學模型的有效預測性。結果表明：料液比、提取溫度、提取時間是影響枇杷葉多酚提取率的主要因素；隨著料液比和提取溫度的增加，枇杷葉多酚提取率呈先上升后下降的趨勢，二者交互作用差異具有統(tǒng)計學意義。試驗檢驗了枇杷葉多酚的最佳提取條件為：料液比1 ∶ 21（g ∶ mL）、乙醇濃度48.5%、溫度60 ℃、浸提時間2.6 h，獲得提取率為3.40%，該值與理論預測值3.44%接近，證明該模型可較好的指導枇杷葉多酚的提取條件。

關鍵詞 枇杷葉；多酚；提取率；響應面分析

中圖分類號 O657.63 文獻標識碼 A

枇杷[Eriobotrya japonica（Thumb.）Lindl.]別名盧橘，為薔薇科枇杷屬植物，因葉形似琵琶得名。中國是枇杷的主產(chǎn)地，其產(chǎn)量約占全世界總產(chǎn)量的67%。枇杷葉、花、果實都有極高的藥用價值，可謂“周身遍是寶”，并且其營養(yǎng)價值也很高[1]。常用作中藥材的枇杷葉為枇杷的干燥葉，枇杷葉味苦，性微寒，歸脾、肺經(jīng)，具有清熱止咳、降逆和胃的功效，特別是用于治療肺熱咳嗽、胃熱嘔逆等[2]。據(jù)報道，從枇杷葉中已分離得到的有效成分主要有揮發(fā)油、三萜酸類、多酚類、黃酮類、倍半萜類、有機酸類等化合物[3]。植物多酚具有很高的生物活性，擁有極強的抗氧化和抑菌能力[4]，目前對枇杷葉的研究主要集中在三萜酸類化合物，但對枇杷葉多酚的報道比較少，為了更深入的研究枇杷葉多酚的生理活性，本研究利用響應面分析法優(yōu)化枇杷葉多酚的提取工藝，達到節(jié)省材料，提高利用率的目的，以期對枇杷葉多酚的開發(fā)利用提供理論指導。

響應面分析（Response Surface Methodology，RSM）是利用合理的試驗設計，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數(shù)關系，通過分析回歸方程來求得最佳工藝參數(shù)，以解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法。與其它分析方法相比具有試驗周期短，回歸方程精確度高，能研究多因素間交互作用等優(yōu)點[5]。本實驗在單因素試驗的基礎上，選取料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時間4個因素進行Box-Behnken Design（BBD）優(yōu)化枇杷葉多酚的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 于2013年12月在福建省莆田市白沙鎮(zhèn)山地果園，土壤為山地黃壤、偏酸性的枇杷種植基地，選擇生長一致、管理水平相同的早鐘六號枇杷（8年生），隨機采摘略帶黃色的成熟老葉；經(jīng)清水清洗，除去表面灰塵及雜物，然后置于50 ℃烘箱烘干（含水量低于1%），粉碎后過60目篩，所得的枇杷葉粉末貯存于-20 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑與儀器 主要試劑：沒食子酸（色譜純，國藥集團化學試劑公司），福林酚試劑（國藥集團化學試劑公司），無水乙醇（分析純），無水碳酸鈉（分析純），水為蒸餾水。

主要儀器：日本日立UV-2009型雙光束分光光度計；EL204型電子天平，購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；101-0型電熱鼓風干燥箱，購自天津市泰斯特儀器有限公司；Eppendorf 5810R臺式高速大容量離心機；DK-S24型數(shù)顯恒溫水浴鍋，購自上海精宏實驗設備有限公司；FW177型中草藥粉碎機，購自天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的繪制 準確稱取10 mg沒食子酸標準品，定容于100 mL容量瓶制成0.1 mg/mL的沒食子酸標準溶液，分別吸取100、200、300、400、500、600 μL標準溶液于10 mL容量瓶中，然后分別加入1 mL福林酚試劑和2 mL 15%的碳酸鈉溶液，常溫下避光反應2 h，在765 nm波長處測定樣品的吸光值。以樣品濃度為x軸，吸光值為y軸繪制沒食子酸標準曲線（圖1）。

通過線性分析得到回歸方程，求的回歸方程為：y=0.127 2 x+0.052 4，其中x為沒食子酸濃度，單位為mg/L，y為吸光度，R2=0.998 8。

1.2.2 枇杷葉多酚的提取及含量測定 精密稱取枇杷葉粉末，按照一定的料液比加入已知濃度的乙醇溶液中，置于一定溫度的恒溫水浴鍋內(nèi)加熱提取，浸提結束后取上清液冷卻，離心。將100 μL提取液定容至5 mL，避光靜置1 min，準確吸取100 μL待測液，加入1 300 mL蒸餾水，混合均勻，然后加入200 μL福林酚試劑和400 μL碳酸鈉溶液（質量分數(shù)為15%），避光充分反應2 h，于765 nm處測定吸光值，根據(jù)回歸方程計算枇杷葉多酚質量。每個實驗做3次重復，取平均值。枇杷葉多酚提取率按下列公式計算：

多酚提取率/%=×100

其中，y為吸光值；m為枇杷葉質量（g）。

1.2.3 單因素及其響應面優(yōu)化試驗設計 準確稱取1.0 g枇杷葉粉末，在料液比、乙醇濃度（乙醇濃度為0%時的空白提取率為1.83%，遠低于乙醇高濃度的提取率）、提取溫度和提取時間等4個單因素條件下（表1），確定提取因素的變化范圍及各因素的適應值。將每次提取上清液離心、定容、避光反應，檢測提取液中枇杷葉多酚的含量，并折算為得率。

在此基礎上，根據(jù)Box-Behnken的試驗設計原理，每個自變量取3個水平（依據(jù)單因素試驗結果），以-1、0、1進行編碼，以枇杷葉多酚提取率為響應值。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS與Design Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素對枇杷葉多酚的影響

料液比為1 ∶ 10～1 ∶ 20時，隨著料液比的提高枇杷葉多酚溶出的更加充分，提取率也明顯增加（圖2-A）；當料液比達1 ∶ 20后，由于多酚已基本溶出，對提取率增加不大，為了節(jié)省原料，選擇1 ∶ 20為佳。

隨著乙醇濃度的增加，枇杷葉多酚提取率增加（圖2-B）。乙醇濃度的提高，加速了多酚與其他物質連接的氫鍵的斷裂，促進了多酚溶解在乙醇溶液當中，提取率增大[6]。當乙醇濃度為50%時，多酚提取率最大；乙醇濃度超過50%時，隨著濃度的提高枇杷葉提取率反而下降，其原因可能是：多酚與溶劑的極性差異變大，多酚類物質不能充分溶解，導致多酚提取率下降。由此確定乙醇的最佳濃度為50%。

在40～60 ℃時，隨著溫度的上升提取率明顯增加（圖2-C）。提取溫度的升高加速了分子的運動，促進了枇杷葉多酚在乙醇溶液中的溶出。高于60 ℃時，隨提取溫度的升高，多酚提取率下降，由于溫度過高反而破壞了多酚結構，水和乙醇揮發(fā)，雜質溶出增加，乙醇提取枇杷葉多酚的最佳溫度為60 ℃。

料液接觸時間越長越有利于枇杷葉多酚的溶出，當達到2.5 h時，提取率趨于穩(wěn)定（圖2-D），所以最佳浸提時間選擇2.5 h。

2.2 枇杷葉多酚的響應面分析

根據(jù)單因素實驗的結果，所選響應因子及水平見表2。

所有測定實驗重復3次，以枇杷葉多酚提取率為響應值的響應面試驗設計與結果見表3，得到枇杷葉多酚提取率（Y）對料液比（X1）、乙醇濃度（X2）、提取溫度（X3）、提取時間（X4）的二次多項回歸模型為：

Y=3.36+0.15X1+0.04X2+0.066X3+0.28X4-0.04X1X2+0.14X1X3+0.034X1X4+0.001X2X3-0.063X2X4-0.019X3X4-0.24X12-0.29X22-0.36X32-0.31X42（R2=0.981 7）

為了檢驗方程的有效性，對多酚提取的數(shù)學模型進行方差分析。由表4可知，枇杷葉多酚提取率為響應值時，該二次方程模型極顯著（p<0.010 0）。回歸方程失擬性檢驗無統(tǒng)計學意義（p=0.171 3），表明未知因素對試驗結果干擾很?。换貧w方程的相關系數(shù)（R2=0.981 7，Adj-R2=0.963 5，Pred-R2=0.904 6）及變異系數(shù)CV（2.20%）均表明模型方程能夠較好地反映真實的試驗值。該方程與實際情況擬合很好，較好地反映了枇杷葉多酚提取率與料液比、乙醇濃度、提取溫度和提取時間的關系，因此所得的回歸方程能較好的預測多酚提取率隨各參數(shù)的變化規(guī)律。實驗所選4個因素中X1、X2、X3、X4和X1X3及二次項的影響差異顯著，其中X1、X3、X4為極顯著，說明料液比、提取溫度、提取時間均對枇杷葉多酚提取率有極顯著影響，乙醇濃度影響最弱，但也達到了有統(tǒng)計學意義水平（p<0.05），并且料液比和提取溫度交互作用極明顯。綜合以上各參數(shù)表明該試驗方法可靠，各因素水平間設計合理，因此可用該回歸模型代替實驗真實地對結果進行分析。

響應面圖形是響應值對各試驗因子X1、X2、X3、X4所構成的三維空間的曲面圖（圖3），從圖3可以看出，最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用。當響應面分析圖為山谷形曲面，特征值均為正值，有極小值存在；當響應面分析圖為山丘曲面時，特征值為負值，有極大值存在；當響應面分析圖為馬鞍形曲面時，特征值有正有負，無極值存在[7]。根據(jù)回歸方程得出不同因子的響應面分析圖及相應等值線圖，分析兩兩因素交互作用對提取效果的影響。通過Design Expert 8.0.6軟件對各因素之間的交互作用進行響應面分析，繪制響應面曲線圖。等高線圖可直觀反映出2個變量間交互作用的顯著程度，其中圓形表示兩兩因素交互作用不顯著，而橢圓形表示兩兩因素交互作用顯著[8]。料液比和提取溫度之間表現(xiàn)為曲面較陡，交互作用顯著（圖3）；當料液比一定，提取溫度小于60 ℃時，提取率隨溫度的升高而急劇增大；隨著溫度高于60 ℃時，提取率開始下降，變化明顯。當溫度一定時，料液比的變化會顯著影響枇杷葉多酚的提取率。其他交互作用方差分析p值均大于0.05，表明對于枇杷葉多酚提取率的影響，交互作用不明顯。

2.3 枇杷葉多酚提取最優(yōu)工藝及其驗證

料液比、提取溫度和提取時間是影響枇杷葉多酚提取率的最主要因素，乙醇濃度次之，選擇合適的提取條件，可獲得較高的枇杷葉多酚提取率。通過對解決方案的分析，考慮到節(jié)省物料、時間與提取率最高等因素，對若干響應面結果進行最優(yōu)分析驗證，結果見表5。通過分析進行驗證試驗，得到枇杷葉多酚提取率的實際值，該值與理論預測值進行比較，計算相對誤差。通過驗證實驗結果發(fā)現(xiàn)，提取工藝的最佳理論方案：料液比為1 ∶ 21.13，乙醇濃度為48.50%，提取溫度為59.75 ℃，提取時間為2.61 h，理論預測提取率為3.44%。實驗實際條件：料液比為1 ∶ 21，乙醇濃度為48.5%，溫度為60 ℃，時間為2.6 h，得到枇杷葉多酚提取率的實際值為3.40%，提取率最高，且該值與理論預測值3.44的相對誤差僅為1.18%，說明該模型具有好的分析能力，可為實際操作提供良好的指導。

3 討論與結論

有機溶劑萃取、超聲輔助浸提、超臨界流體萃取及微波輔助浸提等常用于植物多酚的提取。但由于植物種類的不同或植物體的不同部位，在提取多酚類物質時，需考慮采用不同工藝或不同的工藝參數(shù)[9]。為了獲取高提取率、高純度、性能優(yōu)良的多酚物質，采用響應面分析法優(yōu)化提取工藝，以達到省時、高效、節(jié)能、環(huán)保的目的。Seiad等[10]應用響應面分析法研究結果表明，在45 ℃萃取溫度條件下，哈列朋松（Pinus halepensis Mill）樹皮多酚提取率最高。在石榴皮多酚提取的正交試驗優(yōu)化工藝中，乙醇濃度為20%，料液比為1 ∶ 20，可獲得最佳多酚提取率為22.86%[11]；在石榴渣多酚時，乙醇濃度為50%，從中分離出多種多酚單體[12]。枇杷葉多酚萃取最佳提取工藝：料液比為1 ∶ 21，乙醇濃度為48.5%，溫度為60 ℃，時間為2.6 h；通過與不同材料多酚提取進行比較，結果表明不同物種多酚萃取工藝參數(shù)差異較大，推測枇杷葉多酚的含量及其所含單體的極性差異，這方面尚需進一步純化鑒定，與石榴多酚提取液濃度大致相同，推斷枇杷葉多酚可能含有大量與石榴多酚類似單體。本試驗運用響應面法對枇杷葉多酚提取進行優(yōu)化，提高了枇杷葉多酚提取率。植物酚類物質屬于路易斯酸，因含有酚羥基，具有極性。因此，在分離純化植物多酚時，應考慮選擇具有很強的選擇性和高效性的萃取方法，如可逆絡合反應的有機物萃取分離法[13]。為了更大的提高多酚提取率，先進的提取方法能大幅度提高提取效率，在以后的試驗中將嘗試更多的分析優(yōu)化方法，從而提高提取效率，給予生產(chǎn)加工提供科學指導。

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