曹學順 丁君 白雪秋 常亞青

摘 ?要：為獲知升溫對‘水院1號和大連養(yǎng)殖刺參相關免疫酶活性及MDA含量的影響，實驗設置不同溫度梯度（16、20、24、28℃），分別對‘水院1號和大連養(yǎng)殖刺參體腔液中過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、溶菌酶（LSZ）的活性及丙二醛（MDA）含量進行測定。結果顯示：（1）在升溫過程中，‘水院1號和大連養(yǎng)殖刺參體腔液中CAT、SOD、POD活性均呈先升高后降低的趨勢。CAT活性范圍分別為77.160～151.76、24.617～51.740 U/mL;SOD活性范圍分別為0.070～0.154、0.056～0.100 U/mL;POD活性范圍分別為2.360～3.470、1.407～2.407 U/mL。‘水院1號和大連養(yǎng)殖刺參體腔液中LSZ活性均呈先升高再降低又升高的趨勢，活性范圍分別為9.741～30.898、8.554～28.006 U/mL?！?號刺參體腔液中MDA含量隨著水溫升高逐漸降低，其含量范圍為42.331～46.563 nmol/mL，大連養(yǎng)殖群體刺參體腔液中MDA含量呈先降低后升高的趨勢，變化范圍為46.079～47.329 nmol/mL。（2）在升溫過程中，‘水院1號刺參體腔液中CAT、SOD、POD和LSZ活性變化較大連養(yǎng)殖群體刺參的變化差異大，其中CAT和POD活性變化差異顯著（P<0.05）。在28℃水溫下，‘水院1號刺參MDA含量顯著小于大連養(yǎng)殖群體刺參MDA含量（P<0.05）。研究表明，刺參能夠?qū)λ疁厣呒皶r地做出生理免疫反應，通過調(diào)節(jié)非特異性免疫酶活性來清除機體內(nèi)多余的活性氧，保護機體免受環(huán)境改變造成的損害。研究發(fā)現(xiàn)，‘水院1號刺參較大連養(yǎng)殖群體刺參反應更為靈敏，對高溫的適應性更強。本研究為探討刺參對高溫適應性和對‘水院1號品種推廣具有一定意義。

關鍵詞：刺參;升溫;免疫酶;丙二醛

中圖分類號：S968.9 ? ?文獻標志碼：A ? ?論文編號：2014-0269

The Study of Rising Temperature on Serum Non-specific Immune in Shuiyuan NO.1 Sea

Cucumber Populations and the Cultured Sea Cucumber Populations

Cao Xueshun， Ding Jun， Bai Xueqiu， Chang Yaqing

（Dalian Ocean University， Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North Chinas Sea，

Ministry of Agriculture，College of Fisheries and Life Science， Dalian 116023， Liaoning， China）

Abstract： The experiment studied the change of non-specific immune in rising temperature （16℃， 20℃， 24℃，28℃）. The activities of CAT， SOD， POD， LSZ and the content of MDA in Shuiyuan NO.1 sea cucumber and Dalian cultured sea were analyzed. The result show that： （1） in rising temperature，the change of CAT， SOD， POD were trend to increased and to decreased in Shuiyuan NO.1 sea cucumber and Dalian cultured sea cucumber， the activities of CAT were 77.160-151.76 U/mL and 24.617-51.740 U/mL， the activities of SOD were 0.070-0.154 U/mL and 0.056～0.100 U/mL， the activities of POD were 2.360-3.470 U/mL and 1.407-2.407 U/mL. The change of LSZ was first increased and then decreased and increased， the activities of LSZ were： 9.741-30.898 U/mL and 8.554-28.006 U/mL. The content of MDA in Shuiyuan NO.1 sea cucumber was trend to increased， the change of MDA was 42.331-46.563 nmol/mL.The content of MDA in Dalian cultured sea cucumber was trend to decreased and to increased， the change was 46.079-47.329 nmol/mL.（2） In rising temperature， the change of CAT， SOD， POD， LSZ in Shuiyuan NO.1 sea cucumber were more sensitive than in Dalian cultured sea cucumber， and the change of CAT and POD had significant difference （P<0.05）. In 28℃， the content of MDA in Shuiyuan NO.1 sea cucumber was significantly less than in Dalian cultured sea cucumber （P<0.05）. The study indicated that Apostichopus japonicus （Selenka） could make certain physiological immune response to elevated temperatures， to rid the body of excess free radicals by regulating the immune defense enzyme activity， to protect body from damage caused by environmental change. Shuiyuan NO.1 sea cucumber was more sensitive and had hight adaptation in high temperature than Dalian cultured sea cucumber. The experiment was important to study the high temperature adaptation of Apostichopus japonicus （Selenka）and to promote Shuiyuan NO.1 sea cucumber.

Key words： Apostichopus japonicus （Selenka）; Heating; Immune; Malondiadehyde

0 ?引言

水溫作為最重要的生態(tài)因子之一，對刺參生長和生理生態(tài)特征起到非常重要的作用[1]。刺參所能適應的水溫范圍為0～30℃，最適生長溫度為15～18℃[2]。超出適宜水溫可造成刺參體內(nèi)自由基代謝紊亂，自由基在體內(nèi)大量累積，繼而影響刺參體內(nèi)免疫系統(tǒng)的防御能力，損害刺參健康。溫度過高或過低都會抑制刺參生長，增加發(fā)病率[1]。另外在夏季水溫升高時，刺參為適應高溫環(huán)境會進入夏眠，停止攝食，體重減輕，且刺參體腔液非特異性免疫酶活性發(fā)生明顯變化[3]。因此，研究升溫對刺參體腔液中免疫酶活性的影響對于探討其對高溫環(huán)境的適應機制和健康養(yǎng)殖具有一定借鑒意義。

刺參對水溫的適應具有特殊性和復雜性，與刺參年齡及規(guī)格有關，規(guī)格越大，其適宜生長溫度越低[1]。目前溫度對水生動物的生理影響的研究比較廣泛。Wang F等[3-4]研究了夏眠期間刺參體腔液內(nèi)免疫酶活性變化，Ji等[5]研究了升溫與夏眠過程中刺參的免疫生理反應，劉偉等[6]初步探討了溫度驟降和緩降對刺參體腔液中主要免疫酶的影響，Dong等[7]研究了在不同幅度的日變溫處理下，刺參體內(nèi)CAT和SOD活性變化，An等[8]研究了高溫下刺參食物吸收率和食物轉(zhuǎn)化率的變化，Dong等探討了高溫馴化下刺參的熱耐受性[9]及對其它生態(tài)因子的耐受能力[7]。另外也有學者研究了褐牙鲆[10]、中華絨螯蟹[11]、青蛤[12-13]、蝦夷扇貝[14]、貽貝[15]等水生動物體內(nèi)非特異性免疫酶活性與溫度之間的關系。

2009年大連海洋大學培育出的刺參新品種‘水院1號是國家審定通過的第1個刺參養(yǎng)殖新品種，具有苗種成活率高、生長快、肉刺多等特點[6，16]。本研究以‘水院1號刺參和大連養(yǎng)殖群體刺參為材料，研究在水溫緩升條件下，兩群體刺參體腔液中非特異性免疫酶活性和MDA含量的變化，為探討刺參對高溫的適應機制和刺參健康養(yǎng)殖具有參考價值，同時也為研究‘水院1號對高溫條件的適應性及對其的推廣有一定意義。

1 ?材料與方法

1.1 ?實驗材料

實驗選用大連海洋大學農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室培育的‘水院1號刺參（158.63 g±32.46 g）和2013年購于大連某養(yǎng)殖場的刺參（148.42 g±25.21 g）。實驗開始前取‘水院1號刺參和大連養(yǎng)殖群體刺參各30頭，分別暫養(yǎng)于控溫水槽中2周，養(yǎng)殖溫度為16℃，正常養(yǎng)殖管理。

1.2 ?升溫模式及取樣

利用控溫水槽將養(yǎng)殖刺參水溫從16℃開始升溫，每天水溫升高1℃，每個溫度點維持1天，實驗持續(xù)16天，分別在16、20、24、28℃時取水院1號刺參和大連養(yǎng)殖群體刺參各5頭，抽取刺參體腔液，放入-80℃冰箱保存，留作待測樣本。

1.3 ?刺參體腔液中免疫酶及丙二醛含量測定

每個待測樣品設置3個平行，實驗采用CAT、SOD、POD、LSZ的酶活性測試盒及MDA含量測試盒（南京建成生物研究所）檢測刺參體腔液中相應的免疫酶活性及MDA含量，利用Epoch酶標儀（美國Biotek公司）測定酶活性及MDA含量。

1.4 ?數(shù)據(jù)處理

實驗所得數(shù)據(jù)利用Excel軟件進行初步整理，后用SPSS17.0軟件中單因素方差分析處理各溫度點下刺參體腔液中CAT、SOD、POD、LSZ的活性及MDA含量的數(shù)據(jù)，利用Duncan多重比較分析同群體不同溫度點間和不同群體間刺參各非特異性免疫酶活性和MDA含量的差異顯著性，顯著性水平設置為P<0.05。

2 ?結果與分析

2.1 ?升溫對水院1號和大連養(yǎng)殖刺參體腔液中CAT活性的影響

‘水院1號和大連養(yǎng)殖刺參體腔液中CAT活性變化結果見圖1。隨著水溫升高，‘水院1號和大連養(yǎng)殖刺參體腔液中CAT活性均呈先升高后降低的趨勢。隨著水溫升高，大連養(yǎng)殖群體刺參CAT活性20℃時達到最高，為68.05 U/mL;28℃時CAT活性降到最低，為17.84 U/mL（P<0.05）?！八?號”刺參CAT活性變化趨勢與大連養(yǎng)殖群體刺參CAT活性變化一致，在24℃時CAT活性達到最高，為200.99 U/mL;在28℃時CAT活性顯著降低，達到77.160 U/mL（P<0.05）?！?號刺參體腔液中CAT活性在各溫度點均大于大連養(yǎng)殖群體刺參CAT活性，在24℃和28℃水溫下，‘水院1號刺參CAT活性顯著高于大連養(yǎng)殖群體刺參CAT活性（P<0.05）。

2.2 ?升溫對水院1號和大連養(yǎng)殖刺參體腔液中SOD活性的影響

‘水院1號和大連養(yǎng)殖刺參體腔液中SOD活性變化見圖2。隨著水溫升高，‘水院1號和大連養(yǎng)殖刺參體腔液中SOD活性均呈先升高后降低的趨勢。隨著水溫升高，大連養(yǎng)殖群體刺參體腔液中SOD活性逐漸升高，在24℃時達到最高，為0.100 U/mL;28℃時SOD活性降到最低，為0.056 U/mL，顯著低于24℃時SOD活性（P<0.05）?！?號刺參SOD活性在24℃時達到最高，為0.154 U/mL;28℃時，SOD活性降到最低，為0.070 U/mL，顯著低于24℃時SOD活性（P<0.05）?！?號刺參SOD活性在各溫度點均大于大連養(yǎng)殖刺參SOD活性，但差異不顯著（P>0.05）。

2.3 ?升溫對水院1號和大連養(yǎng)殖刺參體腔液中POD活性的影響

‘水院1號和大連養(yǎng)殖刺參體腔液中POD活性變化見圖3。隨著水溫升高，‘水院1號和大連養(yǎng)殖刺參體腔液中POD活性均呈先升高后降低的趨勢。大連養(yǎng)殖群體刺參體腔液中POD活性在20℃水溫時達到最高，為2.407 U/mL，顯著高于其他3個溫度點下POD活性（P<0.05）;28℃時POD活性最低，為1.407 U/mL。‘水院1號刺參體腔液中POD活性在20℃時達到最高為3.470 U/mL;28℃時POD活性降到最低，為2.360 U/mL;20℃與24℃時POD活性差異顯著（P<0.05）。升溫過程中，‘水院1號刺參在16、24℃及28℃水溫下POD活性均顯著高于大連養(yǎng)殖群體刺參POD活性（P<0.05）。

2.4 ?升溫對水院1號和大連養(yǎng)殖刺參體腔液中LSZ活性的影響

‘水院1號和大連養(yǎng)殖刺參體腔液中LSZ活性變化見圖4。隨著水溫升高，‘水院1號和大連養(yǎng)殖群體刺參體腔液中LSZ活性均呈先升高再降低又升高的趨勢。水溫20℃時，大連養(yǎng)殖群體刺參體腔液中LSZ活性達到最高，為28.006 U/mL;24℃時降到最低，為8.554 U/mL，顯著低于20℃時LSZ活性（P<0.05）;28℃時，LSZ活性有所升高，為22.523 U/mL?！?號刺參在20℃時LSZ活性達到最高，為30.898 U/mL;24℃時，LSZ活性顯著降低（P<0.05），為9.741 U/mL;28℃時，LSZ活性升至24.201 U/mL。升溫過程中，‘水院1號刺參LSZ活性在各溫度點均大于大連養(yǎng)殖刺參LSZ活性，但差異不顯著（P<0.05）。

2.5 ?升溫對水院1號和大連養(yǎng)殖刺參體腔液中MDA含量的影響

生物體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應，氧化終產(chǎn)物為丙二醛（MDA），MDA含量可以間接反映生物機體受損傷的程度?！?號和大連養(yǎng)殖刺參體腔液中MDA含量變化見圖5。隨著水溫升高，大連養(yǎng)殖群體刺參體腔液中MDA含量呈先降低后升高的趨勢，24℃時MDA含量降到最低，為46.079 nmol/mL;28℃時MDA含量達到最高，為47.329 nmol/mL，各溫度點MDA含量差異不顯著（P>0.05）?！?號刺參體腔液中MDA含量隨著水溫升高逐漸降低，其含量值分別為46.563、46.079、45.455、42.331 nmol/mL，28℃時MDA含量顯著降低（P<0.05）。水溫28℃時，‘水院1號刺參體腔液中MDA含量顯著小于大連養(yǎng)殖群體刺參體腔液中MDA含量（P<0.05）。

3 ?討論

3.1 ?升溫對‘水院1號刺參和大連養(yǎng)殖群體刺參免疫酶活性的影響

在自然生長過程中，隨著環(huán)境溫度的變化，刺參機體的生理免疫等反應會發(fā)生一定的變化。溫度升高，會導致刺參代謝水平的變化，增加活性氧的形成，過量的活性氧會打破其和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡，導致氧化脅迫，引起機體組織損傷[17]。

在刺參抗氧化系統(tǒng)中，CAT和SOD是最先和最重要的防御機制[18]。CAT是生物體內(nèi)過氧化物酶體的標志酶，能夠催化過氧化氫分解，防止膜脂過氧化。SOD是第1個對抗活性氧自由基的抗氧化酶，參與清除體內(nèi)超氧陰離子自由基（O2-），可以防機體損傷和衰老[19]。本研究結果顯示，隨著水溫升高，‘水院1號和大連養(yǎng)殖刺參體腔液中CAT和SOD活性均呈先升高后降低的趨勢，這與Ji等[5]、Dong等[7]、徐東東等[10]、洪美玲等[11]的研究結果一致。說明在升溫過程中，刺參能夠通過提高CAT和SOD活性來清除多余的活性氧，在無脊椎動物中CAT和SOD活性隨溫度升高變化趨勢具有一致性。當水溫從24℃升至28℃時，刺參機體內(nèi)CAT和SOD活性均降低，分析原因可能是刺參經(jīng)歷溫度過高導致CAT和SOD活性受到抑制。

POD也是抗氧化系統(tǒng)中的關鍵酶，能夠催化過氧化氫反應，與CAT、SOD一起在環(huán)境脅迫下清除機體內(nèi)多余的活性氧自由基保護細胞。吳丹華等[20]報道了在低溫脅迫下三疣梭子蟹血清中POD活性呈先升高后降低的趨勢。目前還未見在高溫下刺參POD活性變化的報道。本研究顯示，隨著溫度升高，刺參體腔液中POD活性也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，表明刺參為防御機體免受升溫的刺激，機體提高了POD活性來適應高溫，在28℃水溫下，POD活性顯著降低（P<0.05），推測是因水溫過高，POD活性受抑制。

LSZ是吞噬細胞殺菌的物質(zhì)基礎，能夠清除侵入體內(nèi)的異物，達到保護機體的目的[21]。溫度對LSZ活性變化起著重要影響[22]。Wang等[3]的研究結果表明刺參LSZ活性從夏眠前期至夏眠期逐漸升高，11月底顯著下降。華育平等[23]的研究表明史氏鱘血清中LSZ活性隨著溫度升高而升高，Langston等[24]報道了升溫會造成大西洋鰈魚血清內(nèi)LSZ酶活性增強。王天坤等認為處于免疫臨界溫度范圍內(nèi)，克氏原螯蝦LSZ活性隨溫度升高而升高，超出范圍時，因溫度脅迫產(chǎn)生應激反應，導致生理功能失調(diào)，機體免疫力下降，感染疾病[25]。本實驗結果顯示，升溫過程中刺參LSZ活性先升高后降低又升高，推測刺參體腔液中免疫酶的作用也有一定的次序，隨著水溫升高機體內(nèi)CAT、SOD和POD活性降低后，LSZ活性升高，保護機體免受損傷。

MDA含量可以反映生物機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細胞損傷的程度[26]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著水溫升高，‘水院1號刺參體腔液中MDA含量逐漸降低，大連養(yǎng)殖群體刺參體腔液中MDA含量先降低后升高，與CAT、SOD、POD的變化趨勢相反，與張喆等[27]研究結果相似。大連養(yǎng)殖群體刺參MDA含量在28℃下達到最高，推測是由于刺參在高溫脅迫下，CAT、SOD和POD活性受到抑制，不能及時清除機體內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，導致MDA含量增加。

3.2 ?升溫過程中水院1號刺參和大連養(yǎng)殖群體刺參免疫酶活性變化的差異

研究發(fā)現(xiàn)，在升溫過程中，‘水院1號刺參和大連養(yǎng)殖群體刺參能夠通過調(diào)節(jié)非特異性免疫酶活性來適應溫度升高造成的影響，保護機體免受損傷。隨著水溫升高，‘水院1號刺參體腔液中CAT、SOD、POD和LSZ活性變化較大連養(yǎng)殖群體刺參的變化大，其中CAT和POD活性變化差異顯著（P<0.05），表明‘水院1號刺參能夠?qū)λ疁厣咦龀龈髴し磻ㄟ^調(diào)節(jié)免疫酶活性來平衡機體內(nèi)氧化過程與抗氧化系統(tǒng)，保護機體免受損害，表現(xiàn)出對高溫的適應性。‘水院1號刺參MDA含量在各溫度點均小于大連養(yǎng)殖群體刺參MDA含量，且在28℃水溫下差異顯著（P<0.05），表明在升溫過程中‘水院1號刺參的機體細胞受損程度小于大連養(yǎng)殖群體刺參，‘水院1號刺參對高溫的適應性較普通刺參強。因此，‘水院1號的推廣更有意義。

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