馬丹 程芳芳 楊帆 滿曉華 高軍 張永鎮(zhèn) 李兆申

·論著·

胰腺癌TAK1、p-TAK1的表達(dá)及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)密度

馬丹 程芳芳 楊帆 滿曉華 高軍 張永鎮(zhèn) 李兆申

目的檢測(cè)胰腺導(dǎo)管腺癌及相應(yīng)癌旁胰腺組織TGF-β激活激酶1(TAK1)、磷酸化TAK1(p-TAK1)的表達(dá)及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)的浸潤(rùn)密度，分析二條途徑之間的相關(guān)性及其與腫瘤臨床病理特征的相關(guān)性。方法應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)57例胰腺癌及35例相應(yīng)癌旁正常胰腺組織TAK1、p-TAK1及TAM標(biāo)志物CD68蛋白的表達(dá)，計(jì)算TAM浸潤(rùn)密度，采用SPSS18.0軟件分析它們之間及其與臨床病理特征間的關(guān)系，采用多因素Logistic回歸分析胰腺癌TNM分期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)果胰腺癌組織TAK1、p-TAK1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為42.1%(24/57)和40.4%(23/57)，顯著高于癌旁組織的14.3%(5/35)和11.4%(4/35)；胰腺癌組織CD68陽(yáng)性的TAM高密度浸潤(rùn)者占38.6%(22/57)，顯著高于癌旁組織的8.6%(3/35)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。TAK1蛋白表達(dá)與胰腺腫瘤的最長(zhǎng)徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期顯著相關(guān)；p-TAK1蛋白表達(dá)與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期顯著相關(guān)；TAM浸潤(rùn)密度與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期顯著相關(guān)(P值均<0.05)。胰腺癌組織TAK1、p-TAK1表達(dá)水平均與TAM的浸潤(rùn)密度呈正相關(guān)(P值均<0.01)。多因素Logistic回歸分析顯示胰腺癌組織TAM高密度浸潤(rùn)是高等級(jí)TNM分期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P=0.002，OR=129.5，95%CI6.2～2718.6)。結(jié)論TAK1途徑及TAM在胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，并且兩種機(jī)制可能存在一定的協(xié)同作用。

胰腺腫瘤； 免疫組織化學(xué)； TGF-β激活激酶-1； 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞

絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)家族成員TGF-β激活激酶1(TGF-activated kinase 1, TAK1)可以活化NF-κB和激活蛋白-1(AP-1)，是胰腺癌對(duì)化療藥物耐受性的重要機(jī)制之一，通過(guò)基因沉默或抑制TAK1可以逆轉(zhuǎn)胰腺癌的內(nèi)在耐藥性[1]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumorassociated macro-phage，TAM)與胰腺癌血管生成、轉(zhuǎn)移、免疫抑制、化療抵抗及腫瘤干細(xì)胞的生成等密切相關(guān)[2]。近年的研究證實(shí)，在炎癥刺激的作用下，TAK1的下游靶點(diǎn)之一NF-κB被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)TAM活化，活化的TAM通過(guò)直接或間接作用于Hedgehog信號(hào)通路誘發(fā)和促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生，這可能是TAM促進(jìn)胰腺癌發(fā)展的機(jī)制之一[3]。本課題組以往的研究初步證實(shí)TAK1途徑及Hedgehog信號(hào)通路在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中存在潛在的相互作用[4]，然而關(guān)于TAK1途徑與TAM直接相關(guān)性的研究較少。本研究進(jìn)一步檢測(cè)胰腺癌組織TAK1、磷酸化TAK1(p-TAK1)及TAM標(biāo)志物CD68蛋白的表達(dá)，分析兩條途徑之間的潛在聯(lián)系及其與臨床病理特征的相關(guān)性，探討它們?cè)谝认侔┌l(fā)病中的作用。

材料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

本研究共收集2010年2月7日至2012年9月11日間第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院胰腺外科接受手術(shù)治療的57例患者，獲得每位患者的胰腺癌組織及其中35例配對(duì)的癌旁組織標(biāo)本。所有病例均經(jīng)病理確診為胰腺導(dǎo)管腺癌。57例患者中男性28例，女性29例，年齡32～82歲，平均(58±11)歲。按2009年UICC(國(guó)際抗癌聯(lián)盟)制定的TNM分期，Ⅰ期35例，Ⅱ～Ⅳ期22例。所有患者術(shù)前均未行化療、放療或其他輔助治療。

二、TAK1、p-TAK1、CD68蛋白檢測(cè)

采用免疫組化EnVision染色法(二步法)檢測(cè)TAK1、p-TAK1及CD68蛋白的表達(dá)，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，已知表達(dá)陽(yáng)性的胰腺癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照。兔抗人TAK1及p-TAK1多抗、鼠抗人CD68單抗均購(gòu)自Abcam公司。由2位病理科專家采用雙盲法進(jìn)行讀片，兩者讀片結(jié)果差異<20%時(shí)，取均值；差異≥20%時(shí)則再次判讀，直至意見(jiàn)統(tǒng)一。胞核和胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性。TAK1、p-TAK1蛋白表達(dá)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比以及陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度判定。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，>5%～≤25%為1分，>25%～≤50%為2分，>50%為3分；細(xì)胞無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩分值相乘，0～2分為陰性表達(dá)，3～9分為陽(yáng)性表達(dá)。TAM浸潤(rùn)密度是在200倍光鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)癌組織區(qū)域，計(jì)算每個(gè)區(qū)域內(nèi)CD68陽(yáng)性的TAM數(shù)，取均值。以所有胰腺癌的TAM浸潤(rùn)密度的中位數(shù)作為分界點(diǎn)，將TAM浸潤(rùn)密度分為低密度組和高密度組[5]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。癌與癌旁正常組織TAK1、p-TAK1表達(dá)及TAM密度的差異采用χ2檢驗(yàn)；胰腺癌TAK1、p-TAK1表達(dá)與TAM密度間的相關(guān)性及三者與臨床病理特征的相關(guān)性采用Fisher精確概率法分析。采用Logistic回歸分析胰腺癌TNM分期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、胰腺癌和癌旁組織TAK1、p-TAK1蛋白的表達(dá)及TAM的浸潤(rùn)情況

TAK1及p-TAK1陽(yáng)性表達(dá)于癌細(xì)胞的胞核和胞質(zhì)，癌周炎性細(xì)胞亦有不同程度的表達(dá)(圖1、2)。胰腺癌組織TAK1及p-TAK1陽(yáng)性表達(dá)率分別為42.1%(24/57)和40.4%(23/57)；癌旁組織TAK1及p-TAK1陽(yáng)性表達(dá)于胰腺導(dǎo)管、腺泡和胰島，陽(yáng)性表達(dá)率分別為14.3%(5/35)和11.4%(4/35)，顯著低于胰腺癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為7.775、8.748，P值均<0.01)。

圖1 胰腺癌(1A)和癌旁組織(1B)TAK1的表達(dá)(免疫組化 ×200)

圖2 胰腺癌(2A)和癌旁組織(2B)p-TAK1的表達(dá)(免疫組化 ×200)

CD68陽(yáng)性表達(dá)于TAM的胞核和胞質(zhì)。TAM主要聚集在腫瘤細(xì)胞和癌巢的周圍及腫瘤侵襲的邊緣(圖3)。以所有胰腺癌組織TAM浸潤(rùn)密度中位數(shù)(每個(gè)高倍鏡視野30個(gè))為界，38.6%(22/57)的胰腺癌組織TAM浸潤(rùn)高密度組22例(38.6%)，明顯高于癌旁胰腺組織的8.6%(3/35)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.878，P=0.002)。

圖3 胰腺癌(3A)和癌旁組織(3B)的CD68表達(dá)(免疫組化 ×200)

二、胰腺癌組織TAK1及p-TAK1表達(dá)、TAM浸潤(rùn)密度與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

TAK1表達(dá)與腫瘤最長(zhǎng)徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)；p-TAK1的表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期顯著相關(guān)；TAM浸潤(rùn)密度與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期顯著相關(guān)(表1)。

表1 胰腺癌組織中TAK1、p-TAK1蛋白表達(dá)及TAM浸潤(rùn)密度與臨床病理特征的關(guān)系

三、胰腺癌組織TAK1、p-TAK1表達(dá)水平與TAM浸潤(rùn)密度的相關(guān)性

胰腺癌TAK1及p-TAK1的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.892，P<0.001)，且均與TAM浸潤(rùn)密度呈正相關(guān)(r值分別為0.857、0.817，P值均<0.001)。

四、胰腺癌TNM分期的相關(guān)變量

單因素分析提示，胰腺癌TNM分期與患者年齡、性別及腫瘤部位均無(wú)關(guān)，但與腫瘤最長(zhǎng)徑、分化程度、癌組織TAK1及p-TAK1表達(dá)水平、TAM浸潤(rùn)密度呈正相關(guān)(r值分別為0.280、0.303、0.857、0.817、0.926，P值分別為0.034、0.022、<0.001、<0.001、<0.001)。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，TAM高密度浸潤(rùn)是高等級(jí)TNM分期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P=0.002，OR=129.5，95%CI6.2～2718.6)。

討 論

豐富的腫瘤間質(zhì)是胰腺癌的典型特征之一。胰腺癌間質(zhì)成分包含浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞、星狀細(xì)胞、血管、成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)等，參與腫瘤微環(huán)境的構(gòu)成。TAK1最初因可被TGF-β信號(hào)迅速激活而得名[7]，它是炎癥、免疫、應(yīng)激反應(yīng)及腫瘤發(fā)生過(guò)程中調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子。TAM是最主要的免疫群體，可以接收腫瘤微環(huán)境中多種細(xì)胞分泌的信號(hào)分子，通過(guò)調(diào)控腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞存活、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2,7]。文獻(xiàn)報(bào)道，TAK1與乳腺癌、結(jié)直腸癌、淋巴瘤等的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[8-10]；TAK1與胰腺癌的化療耐受性有關(guān)[11]；胰腺癌組織TAM高密度浸潤(rùn)與患者預(yù)后較差密切相關(guān)[5]。

本研究結(jié)果顯示，胰腺癌高表達(dá)TAK1及p-TAK1，它們的表達(dá)與胰腺癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期顯著相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)TAK1途徑在胰腺癌發(fā)生和發(fā)展中的重要作用。本研究結(jié)果也顯示胰腺癌組織的TAM浸潤(rùn)密度明顯高于癌旁正常組織，且TAM浸潤(rùn)密度與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期顯著相關(guān)，TAM高密度浸潤(rùn)是高等級(jí)TNM分期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示TAM浸潤(rùn)密度也與胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。

TAK1通過(guò)多種形式參與NF-κB的活化，激活的NF-κB又誘導(dǎo)TAM活化，再進(jìn)一步激活Hedge-hog信號(hào)通路，提示胰腺癌的TAK1通路、TAM浸潤(rùn)及Hedgehog信號(hào)通路之間可能存在潛在的相互聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌的TAM浸潤(rùn)密度與TAK1、p-TAK1的表達(dá)水平呈顯著的正相關(guān)，證實(shí)TAM與TAK1途徑在胰腺癌的發(fā)展過(guò)程中存在協(xié)同作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展與炎癥免疫反應(yīng)相輔相成的關(guān)系。

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(本文編輯：屠振興)

Expression of TAK1, pTAK1 proteins and density of tumor associated macrophages in pancreatic carcinoma

MaDan,ChengFangfang,YangFan,ManXiaohua,GaoJun,ZhangYongzhen,LiZhaoshen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LiZhaoshen,Email:Iizhaoshen111@yahoo.com.cn

Objective To investigate the expression of TGF-β activated kinase1 (TAK1), phosphoryted TAK1(p- TAK1) and the density of tumor associated macrophages(TAM) in human pancreatic carcinoma tissues and pairing adjacent normal pancreatic tissues, and explore their relationship. Methods The expression of TAK1, p-TAK1, CD68(the marker of tumor associated macrophages) proteins in 57 samples of pancreatic cancer tissues and 35 samples of pairing adjacent normal pancreatic tissues were detected by immunohistochemical method, then the density of TAM was evaluated. The relationship between the protein expression and TAM, and the relationship between them and clinicopathologic parameters were examined using SPSS 18.0 software, and the independent risk factors of TNM staging were analyzed by multivariate logistic regression. Results TAK1 and p-TAK1 were positively expressed in 42.1%(24/57) and 40.4%(23/57) pancreatic carcinoma tissues, significantly higher than adjacent normal pancreatic tissues [14.3%(5/35) and 11.4%(4/35)]; the proportion of pancreatic carcinoma tissues with high density TAM was 38.6%(22/57), higher than that of adjacent pancreatic tissues [8.6%(3/35)], the differences were statistically significant(P<0.05). TAK1 expression was positively related to tumor size, tumor differentiation, lymph node metastasis, distant metastasis and clinical staging; p-TAK1 expression was positively related to tumor differentiation, lymph node metastasis, distant metastasis and clinical staging; the density of TAM was positively related tumor differentiation, lymph node metastasis, distant metastasis and clinical staging (all thePvalues were less than 0.05). The expression of TAK1 and p-TAK1were positively correlated with the density of TAM(P<0.001). Multivariate logistic regression analysis showed that high density of TAM was independently associated with advanced clinical staging (P=0.002,OR=129.5, 95%CI6.2～2718.6). Conclusions TAK1 pathway and TAM may play an important role in the pathogenesis and progression of pancreatic cancer, and there may be synergy effect between them.

Pancreatic neoplasm; Immunohistochemistry; TGF-β activated kinase-1; Tumour associated macrophage

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.03.006

上海市重中之重臨床醫(yī)學(xué)中心建設(shè)計(jì)劃

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科

李兆申：Email: Iizhaoshen111@yahoo.com.cn

2014-09-11)