耿廣琴，李能蓮,劉 卉，楊雅麗，黃 勇 (.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000； .甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，甘肅 蘭州 730000)

·實(shí)驗(yàn)研究·

黨參水提物對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠肝、腎細(xì)胞DNA和組織結(jié)構(gòu)的影響*

耿廣琴1，李能蓮1,劉 卉2，楊雅麗1，黃 勇1
(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，甘肅 蘭州 730000)

目的: 研究黨參水提物對(duì)衰老模型小鼠肝、腎DNA和肝、腎組織結(jié)構(gòu)的影響，探討黨參保肝、護(hù)腎、抗衰老的機(jī)制，為中醫(yī)藥延緩衰老提供科學(xué)依據(jù)。方法: 將100只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和黨參水提物低、中、高劑量組5組。模型對(duì)照組和黨參水提物低、中、高劑量組每日每只小鼠頸背部皮下注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)50 g/L的D-半乳糖溶液，注射量為0.025 mL/g；正常對(duì)照組注射同體積量生理鹽水。3個(gè)黨參治療各組每日上午按相當(dāng)于生藥量5，10，15 g/kg 3個(gè)劑量給致衰老小鼠灌服黨參水煎液，與造模同步，連續(xù)服藥42 d。采用單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)肝、腎細(xì)胞DNA損傷，石蠟切片法觀察肝、腎組織結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果：給予10,15 g/kg黨參水提物后，小鼠肝腎細(xì)胞DNA尾長(zhǎng)、尾矩、Olive尾矩明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。模型對(duì)照組肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞腫脹，胞漿疏松化，細(xì)胞變性，炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；腎小球萎縮，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性或壞死，灶狀小管萎縮，腎間質(zhì)呈現(xiàn)明顯的纖維化病變。給予黨參水提物后，高劑量組肝細(xì)胞變性明顯改善，炎性浸潤(rùn)顯著減輕；腎小球萎縮明顯緩解，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性減輕，腎間質(zhì)纖維化病變也明顯緩解。結(jié)論: 黨參水提物對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠肝、腎損傷具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)減輕肝、腎細(xì)胞DNA損傷，減緩衰老致肝、腎組織結(jié)構(gòu)退行性病變，達(dá)到延緩衰老的作用，而更深入的機(jī)制探討尚需進(jìn)一步研究。

黨參水提物/藥效學(xué)；衰老/藥物作用；D-半乳糖致衰老模型；DNA損傷；組織結(jié)構(gòu)變化；動(dòng)物；小鼠

衰老是生命過(guò)程中的一個(gè)必然階段。雖然導(dǎo)致和影響衰老的因素很多，但是，五臟是生命活動(dòng)的中心，五臟生理功能正常則生命活動(dòng)就正常，從而維持機(jī)體健康與長(zhǎng)壽；反之，如果五臟虛損，生理功能失常，生命活動(dòng)就失常，進(jìn)而影響健康與壽命；因此，衰老是五臟虛損共同作用的結(jié)果[1]。肝主疏泄，調(diào)節(jié)氣機(jī)，是保持機(jī)體氣機(jī)正常升降出入的重要臟腑[2]。腎為先天之本，腎主藏精，對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育和衰老起著決定性的作用[3]。由此可見，在五臟之中，肝腎虛損與衰老的關(guān)系極為密切，故研究肝臟、腎臟衰老的機(jī)制和延緩肝、腎二臟衰老具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)利用D-半乳糖致衰老模型小鼠為對(duì)象，研究黨參水提物對(duì)衰老模型小鼠肝、腎DNA及肝、腎組織結(jié)構(gòu)的影響，探討中藥黨參保肝護(hù)腎抗衰老的機(jī)制，為中醫(yī)藥延緩衰老提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SPF級(jí)2月齡昆明種小鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量(18±2) g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào): SCXK(甘) 2011-0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

黨參，采自甘肅岷縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)教研室鑒定為白條黨參。取黨參100 g，分2次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加6倍水煎煮1 h，合并兩次提取液，過(guò)濾后濃縮成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 g/mL的水煎劑，置4 ℃冰箱備用，水煎液每 5天制備1次。D-半乳糖，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)063K0044，臨用前用生理鹽水配制成12 g/L備用；正常熔點(diǎn)的瓊脂糖(批號(hào)090M01452A)、低熔點(diǎn)的瓊脂糖(批號(hào)090M01549V)，均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；臺(tái)盼蘭、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、二甲基亞砜(DMSO)、溴化乙錠(EB)等，均為國(guó)產(chǎn)分析純。BS224S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，鄭州杜甫儀器廠產(chǎn)品；XYJ80-20型離心機(jī)，金壇市恒豐儀器廠產(chǎn)品；XW-80A型旋渦混勻器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；DYY-Ⅲ型電泳儀，北京六一廠產(chǎn)品；CKX41-F32FL熒光倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司出品；CX31-12C04光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯公司出品。

1.3 動(dòng)物分組與模型的建立

將100只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組和黨參水提物低、中、高劑量組5組，每組20只，雌雄各半。模型對(duì)照組和黨參水提物低、中、高劑量組每日每只小鼠頸背部皮下注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)50 g/L的D-半乳糖溶液，注射量為0.025 mL/g，正常對(duì)照組注射等體積生理鹽水。黨參治療各組每日上午按相當(dāng)于生藥量5，10，15 g/kg 3個(gè)劑量給致衰老小鼠灌服黨參水煎液，與造模同步，連續(xù)服藥42 d。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

于末次給藥2 h后，稱量各組小鼠體質(zhì)量，斷頭處死小鼠，迅速剖取肝、腎，用預(yù)冷的4 ℃生理鹽水洗凈表面殘血備用。

1.4.1 DNA損傷

采用單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)。用37 ℃的PBS緩沖液沖洗肝、腎組織，分別勻漿，加適量PBS懸浮細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液于1.5 mL的ephendorf管中，靜置下沉3 min，將上部懸液轉(zhuǎn)至另一個(gè)ephendorf管中，800 r/min離心5 min，棄上清，用PBS將細(xì)胞濃度調(diào)整至104～105個(gè)/mL。臺(tái)盼蘭檢測(cè)細(xì)胞活率，大于90%方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。單細(xì)胞凝膠電泳按照Singh[4]描述的方法稍加改進(jìn)，將5 g/L的正常熔點(diǎn)的瓊脂糖液100 μL鋪展到有磨痕的載玻片上，自然風(fēng)干，作為第1層膠；取正常熔點(diǎn)7 g/L瓊脂糖100 μL，鋪第2層膠；去掉蓋玻片后加入制備的細(xì)胞懸液(細(xì)胞懸液體積∶5 g/L的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液體積=1∶8)100 μL鋪展到載玻片上作為第3層。將載玻片浸入新配置的4 ℃預(yù)冷裂解液，裂解2 h，電泳液中解旋30 min，25V，300 mA電泳30 min。電泳完畢后用48.4 g/L Tris-HCl緩沖液中和，EB染色，熒光顯微鏡下觀察，拍照。選擇尾長(zhǎng)、尾矩和Olive尾矩作為DNA損傷指標(biāo)。尾長(zhǎng)即沿電泳方向“彗星”尾部最遠(yuǎn)端與頭部中心之間的距離， 尾矩即尾部DNA占總DNA的百分比與頭、尾部光強(qiáng)度重心間距的乘積， Olive尾矩即從頭部光密度重心到尾部光密度重心的距離與尾部DNA含量的乘積。

1.4.2 肝、腎組織結(jié)構(gòu)

采用石蠟切片法。肝、腎臟組織用40 g/L 多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片(厚度7μm)，HE染色，光鏡下觀察，拍照，MiE顯微圖像分析軟件進(jìn)行分析。單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果采用Kinetic Imaging Comet 4.0軟件進(jìn)行分析，選定目標(biāo)圖像后由軟件自動(dòng)測(cè)量并輸出尾長(zhǎng)、尾矩和Olive尾矩?cái)?shù)據(jù)，每個(gè)樣本隨機(jī)測(cè)量100個(gè)細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)(x)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組間差異采用one-way ANOVA分析。以P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠肝、腎的DNA損傷

模型對(duì)照組小鼠肝、腎細(xì)胞DNA尾長(zhǎng)、尾矩、Olive尾矩較正常對(duì)照組均明顯增加(P<0.01)。給予10，15 g/kg黨參水提物后，小鼠肝腎細(xì)胞DNA尾長(zhǎng)、尾矩、Olive尾矩明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與正常對(duì)照組對(duì)比，黨參水提物低、中、高各劑量組小鼠肝、腎細(xì)胞DNA尾長(zhǎng)、尾矩、Olive尾矩仍呈現(xiàn)明顯的增高趨勢(shì)(P<0.01或P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠肝、腎細(xì)胞DNA損傷對(duì)比n=20，x±s

注：與模型對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05，**P<0.01； 與正常對(duì)照組對(duì)比， #P<0.05，##P<0.01。

2.2 小鼠肝、腎組織結(jié)構(gòu)變化

正常對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞為典型多邊形腺上皮細(xì)胞，以中央靜脈為中心，向四周呈放射排列，肝細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞形態(tài)完整、整齊，細(xì)胞核圓形位于細(xì)胞中央，核膜清楚，核仁也清晰可見。模型對(duì)照組肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞腫脹，胞漿疏松化，細(xì)胞脂肪變性清晰可見,炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。黨參低劑量組肝細(xì)胞形態(tài)依然不齊，細(xì)胞脂肪變性、炎性浸潤(rùn)明顯。黨參中劑量組中央靜脈周圍部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，但距離中央靜脈略遠(yuǎn)處細(xì)胞脂肪變性仍較明顯。黨參高劑量組肝細(xì)胞變性明顯改善，炎性浸潤(rùn)顯著減輕,細(xì)胞邊界較為清晰,形態(tài)較完整，細(xì)胞排列也較為整齊。見圖1。

正常對(duì)照組

模型對(duì)照組

黨參水提物低劑量組

黨參水提物中劑量組

黨參水提物高劑量組

正常對(duì)照組小鼠腎小球呈圓形，外周規(guī)整，腎小囊的囊腔正常，腎小管的管腔規(guī)整。模型對(duì)照組小鼠腎小球不規(guī)整，可見部分萎縮的腎小球，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性或壞死，灶狀小管萎縮，腎間質(zhì)呈現(xiàn)明顯的纖維化病變。黨參水提物各組腎組織異常變化有所改善，其中高劑量組腎小球萎縮明顯緩解，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性有所緩解，腎間質(zhì)纖維化病變也明顯緩解。見圖2。

正常對(duì)照組

模型對(duì)照組

黨參水提物低劑量組

黨參水提物中劑量組

黨參水提物高劑量組

3 討 論

DNA是生命遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是生命信息的載體，它的穩(wěn)定對(duì)于生命體的正常繁殖和生長(zhǎng)至關(guān)緊要。研究表明，隨年齡增長(zhǎng)，機(jī)體內(nèi)DNA損傷程度明顯增加[5-7]，而DNA損傷修復(fù)能力明顯下降[8-10]。當(dāng)DNA損傷累積到一定程度后可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失調(diào)，從而引起生物體適應(yīng)性降低并最終表現(xiàn)為衰老[11]。

本研究中的單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果顯示：模型對(duì)照組小鼠肝、腎細(xì)胞DNA損傷程度明顯增加。給予黨參水提物后，小鼠肝、腎細(xì)胞DNA損傷減輕，高劑量組減輕尤為顯著。此說(shuō)明高劑量黨參水提物可通過(guò)減緩肝、腎細(xì)胞DNA損傷的方式而起到延緩衰老的作用；但與正常對(duì)照組對(duì)比，黨參水提物各劑量組肝、腎細(xì)胞DNA還是處于較高的損傷狀態(tài)，說(shuō)明黨參只能在一定程度上減輕肝、腎細(xì)胞DNA的損傷，并不能完全扭轉(zhuǎn)衰老致DNA損傷的積累。

病理切片觀察顯示：模型對(duì)照組肝細(xì)胞腫脹，胞漿疏松化，細(xì)胞出現(xiàn)明顯變性、壞死；部分腎小球萎縮，腎間質(zhì)呈現(xiàn)明顯的纖維化病變。肝、腎臟是人體的重要器官，其結(jié)構(gòu)的異常改變必然導(dǎo)致肝、腎組織功能的下降。給予黨參水提物后，肝細(xì)胞變性改善，炎性浸潤(rùn)減輕，腎小球萎縮緩解，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性減輕，揭示黨參水提物對(duì)衰老致肝、腎組織結(jié)構(gòu)損傷有一定的修復(fù)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：黨參水提物對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠肝、腎損傷具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)減輕肝、腎細(xì)胞DNA的損傷，減緩衰老致肝、腎組織結(jié)構(gòu)退行性病變，達(dá)到延緩衰老的作用，而更深入的機(jī)制探討尚需進(jìn)一步研究。

[1]周安方,郭煜暉,舒勁松.腎脾虛損導(dǎo)致衰老的機(jī)理探析[J].湖北中醫(yī)雜志，2011,33(8):23-24.

[2]王玉芳.肝調(diào)節(jié)氣機(jī)是補(bǔ)腎健脾抗衰老的前提[J].中醫(yī)藥信息， 2012,29(1): 8-9.

[3]楊婧,杜萬(wàn)紅.淺談中醫(yī)學(xué)對(duì)衰老的認(rèn)識(shí)[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2010,16(8): 129-131.

[4]Singh NP,McCoy MT,Tice RR,et al.A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells[J].Exp Cell Res，1988,175(1): 184-191.

[5]Chevanne M,Caldini R,Tombaccini D,et al.Comparative levels of DNA breaks and sensitivity to oxidative stress in aged and senescent human fibroblasts: a distinctive pattern for centenarians[J].Biogerontology，2003,4(2): 97-104.

[6]Sedelnikova OA,Horikawa I,Zimonjic DB,et al.Senescing human cells and ageing mice accumulate DNA lesions with unrepairable double-strand breaks[J].Nat Cell Biol,2004,6(2):168-170.

[7]Hamilton ML,Van Remmen H,Drake JA ，et al.Does oxidative damage to DNA increase with age[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(18):10469-10474.

[8]Waldstein EA,Peller S,Setlow RB.UV-endonuclease from calf thymus with specificity toward pyrimidine dimers in DNA[J].Proc Natl Acad Sci USA,1979,76(8):3746-3750.

[9]Nette EG,Xi YP,Sun YK,et al.A correlation between aging and DNA repair in human epidermal cells[J].Mech Ageing Dev,1984,24(3):283-292.

[10]韓宗超,張?zhí)K明,方思羽，等.彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)氧化介導(dǎo)的大鼠神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷與修復(fù)[J].中華老年醫(yī)學(xué)雜志,2000,19(2):115-118.

[11]Bahar R,Hartmann CH,Rodriguez KA，et al.Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart[J].Nature,2006,441(7096):1011-1014.

(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)12-0063-04

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.12.30

耿廣琴(1971-)，女，甘肅蘭州人， 講師，碩士，主要從事生物化學(xué)的教學(xué)及研究。

楊雅莉，講師，yali5642@sina.com

甘肅省教育廳科研項(xiàng)目 (2013A-087)

2015-02-08；

2015-09-10