田廣芳，權 卓，楊麗霞，程 濤，張定華，薛建軍，孫 文，劉銅華(.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 70050； .中國人民解放軍第十醫(yī)院，甘肅 武威 7000； .甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 70050； .北京中醫(yī)藥大學教育部中醫(yī)養(yǎng)生學重點實驗室，北京 0009)

·實驗研究·

新加糖腎康對高糖環(huán)境下人腎小管上皮細胞炎癥因子釋放的作用*

田廣芳1，權 卓2，楊麗霞3，程 濤3，張定華1，薛建軍1，孫 文4，劉銅華4
(1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050； 2.中國人民解放軍第十醫(yī)院，甘肅 武威 733000； 3.甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050； 4.北京中醫(yī)藥大學教育部中醫(yī)養(yǎng)生學重點實驗室，北京 100029)

目的：通過觀察新加糖腎康(簡稱TSK)對高糖環(huán)境下培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞(HK-2)單核細胞趨化因子蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1(IL-1)等炎癥因子釋放的作用，探討其防治炎癥介導的糖尿病腎病的作用及機制。方法：體外培養(yǎng)HK-2 細胞，培養(yǎng)基為含 10 % 胎牛血清的1640培養(yǎng)基，實驗分為 6 組：空白對照組、高糖組(30 mmol/L D-葡萄糖)、空白血清對照組(30 mmol/L D-葡萄糖+10%空白血清)、新加糖腎康低劑量組(30 mmol/L D-葡萄糖+5% TSK藥物血清)、新加糖腎康中劑量組(30 mmol/L D-葡萄糖+10% TSK藥物血清)、新加糖腎康高劑量組(30 mmol/L D-葡萄糖+20% TSK藥物血清)。每組細胞在藥物干預24h、48h后，ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中MCP-1、TNF-α和IL-1的含量。結果：正常培養(yǎng)的HK-2細胞經(jīng)高糖條件培養(yǎng)后，炎癥因子MCP-1、TNF-α和IL-1的釋放顯著增加，與空白對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但經(jīng)新加TSK含藥血清干預后，炎癥因子的釋放開始減少，與高糖組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論：中藥復方新加TSK能夠抑制高糖環(huán)境下人腎小管上皮細胞炎癥因子的釋放，這可能是其防治糖尿病腎病的機制之一。

新加糖腎康；高糖；人腎小管上皮細胞；炎癥因子；動物；大鼠

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，在糖尿病所有并發(fā)癥中占主要地位。DN的防治一直是廣大科技工作者的主要研究領域，但目前對于DN的發(fā)病機制尚未完全闡明。近年來，隨著炎癥學說在醫(yī)學各領域的興起，有關DN的炎癥發(fā)病機制也逐漸引起了人們的注意。已有研究表明DN與慢性炎癥相關，認為DN就是一種免疫炎癥性疾病[1]。因此，增強機體免疫力，減少炎癥細胞因子對腎臟組織包括腎小球、腎小管的炎癥損傷已成為防治DN的新思路。糖腎康是甘肅省中醫(yī)院劉國安教授和張定華主任醫(yī)師經(jīng)過多年的臨床實踐，通過多次藥物篩選，經(jīng)過反復論證確立的經(jīng)驗方，具有益氣養(yǎng)陰、清熱祛濕、活血化瘀的功效。既往研究發(fā)現(xiàn)：該方對2型糖尿病患者血流變學指標具有一定的改善作用，并能減少尿微量白蛋白和24 h尿蛋白定量，臨床治療DN效果良好[2]。本課題在前人研究的基礎上，結合北京中醫(yī)藥大學劉銅華教授治療DN的學術思想[3]，通過專家討論，對本方進行了再次優(yōu)化，形成了新加糖腎康(TSK)組方。根據(jù)DN的炎癥發(fā)病機制，本研究通過觀察其對高糖環(huán)境下培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞單核細胞趨化因子蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1(IL-1)等炎癥因子釋放的作用，進一步闡明其防治DN的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與動物

人腎小管上皮細胞株(HK-2)購于上海斯信生物科技有限公司。雄性SPF級Wistar大鼠購于甘肅中醫(yī)學院動物中心，許可證號：SCXK(甘)2004-0006。

1.2 藥品、試劑與儀器

新加糖腎康由黃芪、生地黃、槐米、大黃、益母草、山楂、水蛭組成，所用中藥材購于甘肅省中醫(yī)院藥劑科，用時水提醇沉，冷藏備用；D-葡萄糖，汕頭西隴化工有限公司產(chǎn)品，批號0810142，用時配成30 mmol/L的溶液[4]。1640培養(yǎng)基、胎牛血清，均為Gibco公司產(chǎn)品，批號依次為1237579，12657-029；人MCP-1 ELISA試劑盒(批號E0124Hu)、TNF-α ELISA試劑盒(批號E6320Hu)、IL-1 ELISA試劑盒(批號E0077Hu)，均為上海晶天生物科技有限公司產(chǎn)品。MCO-18AIC型二氧化碳培養(yǎng)箱，SANYO公司產(chǎn)品；SW-CJ-2FD型超凈生物安全柜，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司產(chǎn)品；IX51型倒置顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品；MS 352型酶標儀，Labsystems公司產(chǎn)品；MDF-U53V型-80 ℃超低溫冰箱，SANYO公司產(chǎn)品；LMQ.CV型立式滅菌器，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 新加TSK藥物血清的制備

20只雄性Wistar大鼠飼養(yǎng)于甘肅省中醫(yī)藥研究院中藥研究所動物室潔凈柜中，普通飼料喂養(yǎng)。大鼠按照體質(zhì)量排序，采用隨機數(shù)據(jù)表，隨機分為空白組和藥物組，每組10只。藥物組以新加TSK灌胃，劑量為成人臨床用量的6.5倍；空白組采用同體積生理鹽水灌胃。每次灌胃體積為10 μL/體質(zhì)量。早、晚各1次，灌胃3 d。末次灌胃前禁食，不禁水，灌胃30 min后大鼠股動脈采血，冷凍離心，吸取血清，裝入EP管中 -20 ℃保存。

1.4 HK-2細胞培養(yǎng)及分組

HK-2 細胞培養(yǎng)于 37 ℃、體積分數(shù) 50 mL/L CO2細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為含體積分數(shù)100 mL/L 胎牛血清的1640培養(yǎng)基。每天在顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，及時吸棄脫落死亡的細胞，更換新鮮培養(yǎng)基，以免陳舊細胞代謝產(chǎn)物影響細胞生長狀態(tài)。當細胞生長融合達到80%以上，消化液消化細胞，顯微鏡下觀察消化狀態(tài)，待細胞脫落時用完全培養(yǎng)基終止消化，低速離心5 min，用新鮮培養(yǎng)基將細胞重懸，吹打均勻后進行傳代培養(yǎng)。實驗分為6 組。①空白對照組：由1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。②高糖組：在1640培養(yǎng)液中加入30 mmol/L D-葡萄糖，對細胞進行高糖環(huán)境培養(yǎng)。③空白血清對照組：在高糖組的基礎上，加入10%空白血清，對細胞進行干預性培養(yǎng)。④新加糖腎康低劑量組：在高糖組的基礎上，加入5% 新加TSK藥物血清，對細胞進行干預性培養(yǎng)。⑤新加糖腎康中劑量組：在高糖組的基礎上，加入10% 新加TSK藥物血清，對細胞進行干預性培養(yǎng)。⑥新加糖腎康高劑量組：在高糖組的基礎上，加入20%新加TSK藥物血清，對細胞進行干預性培養(yǎng)。

1.5 檢測指標

采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中MCP-1、TNF-α和IL-1的含量。具體方法如下：將傳代培養(yǎng)的細胞吹打均勻，接種在24孔細胞培養(yǎng)板中，劑量為1 mL，每組3孔，接種2板。2 h后在顯微鏡下觀察細胞貼壁狀態(tài)。培養(yǎng)24 h后吸棄上清。每組加入1 mL含藥培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h、48 h時，仔細吸取每孔細胞上清于1.5 mL的 EP管中，4 ℃離心，取上清，低溫保存待測。指標檢測按照ELISA試劑盒說明書進行。檢測前將樣本置室溫慢慢融化，在反應條孔中加入標準品或待測標本，每孔劑量為100 μL。在空白對照孔加入100 μL稀釋液。在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，洗滌反應板，最后加酶標抗體進行酶聯(lián)免疫反應。反應終止后，以空白對照孔調(diào)零，在酶標儀450 nm處測定各孔OD值。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)(x)±標準差(s)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

ELISA結果顯示：HK-2細胞在高糖環(huán)境下培養(yǎng)24 h、48 h后，細胞培養(yǎng)上清中的MCP-1的含量顯著增多，隨之TNF-α和IL-1的含量也顯著增加，在48 h時作用更加顯著，與空白對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在新加TSK干預性培養(yǎng)后，MCP-1的釋放量開始下降，進而TNF-α和IL-1的釋放量也逐漸下降，并隨著藥物質(zhì)量分數(shù)、作用時間的增加，炎癥因子的釋放量越來越少，在TSK高劑量、48h時效果最為顯著，與高糖組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 各組HK-2細胞培養(yǎng)24，48 h MCP-1含量對比 ng·L-1，n=3,x±s

注：與空白對照組對比，*P<0.05；與高糖組對比，#P<0.05。

表2 各組HK-2細胞不同時間TNF-α含量對比 ng·L-1，n=3,x±s

注：與空白對照組對比，*P<0.05；與高糖組對比，#P<0.05。

表3 各組HK-2細胞不同時間IL-1含量對比 ng·L-1，n=3,x±s

注：與空白對照組對比，*P<0.05；與高糖組對比，#P<0.05。

3 討 論

近年來，基于炎癥機制探討糖尿病腎病的研究越來越多，有動物實驗，也有細胞實驗，因此，DN被國內(nèi)外學者稱為免疫炎癥性疾病[1]。研究發(fā)現(xiàn)，當糖尿病患者的血糖得不到很好的控制時，腎臟組織長期處在高糖環(huán)境下，高糖刺激腎小球系膜細胞或腎小管上皮細胞后，單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)大量釋放，引起局部組織單核/巨噬細胞及淋巴細胞被激活，腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞的單核細胞和T淋巴細胞大量遷移，出現(xiàn)了DN的慢性炎性反應[5]。因此，MCP-1是DN炎癥反應的始因子，是腎臟整個炎癥反應鏈條上的關鍵因子。慢性炎癥反應的直接后果是各類炎癥細胞因子的大量釋放，常見的主要有核因子-κB(NF-κB)、細胞黏附分子(ICAM-1)、血管緊張素II(Ang II)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1、白介素-6(IL-6)等[5-8]。這些炎性細胞因子引起腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化，成纖維細胞被激活，細胞外基質(zhì)成分在腎間質(zhì)大量沉積，導致了糖尿病腎間質(zhì)纖維化，而腎間質(zhì)纖維化是各類腎臟疾病發(fā)生、發(fā)展的病理基礎；因此，高血糖—炎癥反應—腎間質(zhì)纖維化—糖尿病腎病，形成了一條DN的炎癥機制反應軸。

DN據(jù)其臨床癥狀，既屬“消渴”，又屬“腎病”。古代醫(yī)家所論述的消渴繼發(fā)“水腫、尿濁、脹滿、關格”等，皆是DN的臨床表現(xiàn)[9]?！吨T病源候論》中所言消渴“其久病變，或發(fā)癰疽，或成水疾”指的是糖尿病病久出現(xiàn)并發(fā)癥，可能出現(xiàn)現(xiàn)代醫(yī)學的糖尿病足或糖尿病腎病引發(fā)的水腫。《三消論》中又說：“夫消渴者，多變?yōu)槊@盲瘡癬痤疿之類或水液妄行而面上腫也”?！蹲C治要訣》亦指出：“三消久而小便不臭，反作甜氣，在溺中滾涌，更有浮溺面如豬脂，此精不禁，真元竭也”。以上古籍皆指出消渴并發(fā)腎病，從癥狀上不難看出其類似于現(xiàn)代的DN。有關DN的中醫(yī)病機，古代醫(yī)家的觀點多集中在腎虛血瘀，主要表現(xiàn)為本虛標實。本虛一般指陰虛、陽虛、氣虛、血虛、脾虛、肺虛、腎虛等先天稟賦不足；標實主要指痰、濕、濁、瘀等后天病理邪實。二者互為因果，相互影響。本課題所選新加糖腎康具有益氣養(yǎng)陰、清熱祛濕、活血化瘀的功效。方中黃芪、生地黃益氣養(yǎng)陰，為君藥；槐米、大黃清熱祛濕，為臣藥；益母草、山楂、水蛭活血化瘀，為佐藥。其中水蛭為新增蟲類藥，加強了組方的活血化瘀作用。本方思想符合DN“本虛標實”的理論基礎，這也是名老中醫(yī)驗方的優(yōu)勢特點之一：遵從中醫(yī)理論，源于臨床實踐。

本研究結果顯示：人腎小管上皮細胞在高糖環(huán)境培養(yǎng)下，MCP-1的釋放量顯著增多，TNF-α和IL-1的釋放也隨之顯著增多，說明高糖是DN炎癥損傷的主要因素。新加糖腎康藥物血清干預性培養(yǎng)后，MCP-1的釋放開始減少，進而TNF-α和IL-1的釋放量也顯著下降，說明新加糖腎康在一定程度上能夠抑制高糖刺激的炎癥因子釋放，有效阻止了DN的進一步發(fā)展，這可能是其防治DN的機制之一。

[1]呂杰，王耀獻，劉玉寧.從炎癥發(fā)病機制探討糖尿病腎病從熱論治[J].中國中西醫(yī)結合腎病雜志，2014，15(1)：60-61.

[2]張東鵬，張定華，王曉暉.糖腎康膠囊對早期糖尿病腎病患者血漿內(nèi)皮素-1、尿微量白蛋白的影響[J].中華實用中西醫(yī)雜志，2010，23(3)：16-18.

[3]楊麗霞.劉銅華教授中醫(yī)診治糖尿病腎病的學術思想[J].國際中醫(yī)中藥雜志，2008，30(5)：385-386.

[4]凌光輝，唐文彬，孫林，等.Smad 錨著蛋白在高糖誘導人腎小管上皮細胞細胞外基質(zhì)沉積中的作用[J].腎臟病與透析腎移植雜志, 2012, 21(4):346-352.

[5]Hartner A, Cordasic N, Klanke B, et al.Renal protection by low dose irbesartan in diabetic nephropathy is paralleled by a reduction of inflammation, not of endoplasmic reticulum stress[J].Biochim Biophys Acta, 2014, 1842(4):558-565.

[6]Giunti S, Barutta F, Perin PC, et al.Targeting the MCP-1/CCR2 System in diabetic kidney disease[J].Curr Vasc Pharmacol, 2010, 8(6):849-860.

[7]Shelbaya S, Amer H, Seddik S, et al.Study of the role of interleukin-6 and highly senstive C-reative protein in diabetic nephropathy in type 1 diabetic patients[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2012, 16(2):176-182.

[8]Iwata Y, Furuichi K, Hashimoto S, et al.Pro-inflammatory/Th1 gene expression shift in high glucose stimulated mesangial cells and tubular epithelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2014, 443(3):969-974.

[9]歐嬌英，高建東.糖尿病腎病的中醫(yī)藥治療[J].中國中西醫(yī)結合腎病雜志，2013，14(7)：656-658.

(編輯 陶 珠)

《中醫(yī)研究》雜志參考文獻格式

a 專 著

[序號]主要責任者.文獻題名[文獻類型標識].出版地:出版者,出版年.起止頁碼(任選).例：[1]劉國鈞，陳紹業(yè)，王鳳翥.圖書館目錄[M].北京：高等教育出版社，1957.15-18.

b 期刊文章

[序號]主要責任者.文獻題名[文獻類型標識],刊名,年,卷(期):起止頁碼.例：[5]何齡修.讀顧城《南明史》[J].中國史研究，1998，6(3)：167-173.

1001-6910(2015)12-0060-03

R587.2

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.12.29

楊麗霞，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導師，yanglixia-415@163.com

甘肅省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學技術研究課題(GZK-2011-13)

2015-05-04；

2015-08-18