楊瑞芳，吳宿慧，魏術(shù)會(huì)，張振凌，李寒冰，李根林(.河南中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 45000; .河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

·實(shí)驗(yàn)研究·

卷柏炒炭前后對(duì)小鼠出血時(shí)間和凝血時(shí)間的影響*

楊瑞芳1，吳宿慧2，魏術(shù)會(huì)2，張振凌2，李寒冰2，李根林2
(1.河南中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450002; 2.河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

目的：對(duì)照研究卷柏炒炭前后對(duì)小鼠出血時(shí)間和凝血時(shí)間的影響，為進(jìn)一步探討卷柏炮制前后作用機(jī)制的研究提供前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：昆明種小鼠隨機(jī)機(jī)分為生理鹽水組、卷柏生品低劑量組、卷柏生品高劑量組、卷柏炭低劑量組和卷柏炭高劑量組5組，每組10只。將卷柏生品、卷柏炭分別制成1，0.5 g /mL兩種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的藥液。各給藥組灌胃相應(yīng)藥液，給藥劑量為20 μL/g,連續(xù)給藥3 d，1 d 1次。生理鹽水組灌胃等體積的生理鹽水作為對(duì)照。采用剪尾法取血，采用玻璃毛細(xì)管法和玻片法分別測定卷柏炭灌胃后對(duì)小鼠出血時(shí)間和凝血時(shí)間的影響。結(jié)果：與生理鹽水組對(duì)比，卷柏生品高劑量組出血時(shí)間、凝血時(shí)間延長，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。卷柏炭低劑量組與生理鹽水組、卷柏生品低劑量組對(duì)比，出血時(shí)間、凝血時(shí)間減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。卷柏炭高劑量組與生理鹽水組、卷柏生品高劑量組對(duì)比，出血時(shí)間、凝血時(shí)間減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。卷柏炭高劑量組與卷柏炭低劑量組對(duì)比，出血時(shí)間、凝血時(shí)間有所減少，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。結(jié)論：卷柏生品具有抗凝血作用；卷柏炭具有促凝血作用，且隨著濃度的增加，效果更顯著。

卷柏；卷柏炭；出血時(shí)間；凝血時(shí)間；動(dòng)物；小鼠

卷柏為蕨類卷柏科(Selaginellaceae)卷柏屬(Selaginella)植物卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring或墊狀卷柏Selaginellapulvinata(HooK.et Grev.)Maxim.的干燥全草[1-2]，又名長生不死草、九死還魂草等[3]。卷柏性味辛、平，歸肝、心經(jīng)，早在《本經(jīng)》中即有記載，被列為上品，述其“主治五臟邪氣，女子陰中寒熱痛，癥瘕血閉絕子”。 卷柏生用具有活血通經(jīng)、破血散結(jié)之功效，用于經(jīng)閉痛經(jīng)，癥瘕痞塊，跌撲損傷；炒炭后可化瘀止血、用于吐血、崩漏、便血、脫肛[4]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為：卷柏生用活血，炒炭止血?！侗静萸笳妗吩?“卷柏，其治有分生熟。生則微寒，力能破血通經(jīng)，故治癥瘕淋結(jié)等癥；炙則辛溫，能以止血，故治腸紅脫肛等癥?！薄度杖A子本草》云:“生用破血，炙用止血?！盵5]。《本草述》也有“燒存性”入藥的記載?，F(xiàn)卷柏多炒炭用于止血，但有關(guān)卷柏炒炭后止血作用的研究尚少。本文對(duì)照研究了卷柏炒炭前后經(jīng)灌胃給藥對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響，以期對(duì)卷柏制炭后促進(jìn)凝血的作用機(jī)制的研究提供前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

昆明種小鼠50只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，河南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(豫)2010-0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

卷柏生品，購自河南省鄭州市本草國藥館，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院陳隨清教授鑒定為卷柏科卷柏屬植物卷柏[S.tamariseina(Beauv.)Spring]；卷柏炭，河南中醫(yī)學(xué)院炮制實(shí)驗(yàn)室自行炮制。9 g/L生理鹽水,山東齊都藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20140926。BSA-220.4型電子稱，上海卓精電子科技有限公司產(chǎn)品；DZF-6050型真空干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；ST2106電磁爐，美的集團(tuán)產(chǎn)品；揚(yáng)帆牌載玻片(25.25 mm×75.25 mm)，鹽城市鹽都區(qū)潘黃鎮(zhèn)文禮玻璃儀器廠產(chǎn)品；玻璃毛細(xì)采血管(內(nèi)徑1 mm ，長100 mm)，華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠產(chǎn)品；其余小鼠灌胃器、手術(shù)剪、電子計(jì)時(shí)鐘、濾紙、注射用針頭等為常規(guī)實(shí)驗(yàn)室用品。

1.3 藥品的制備

1.3.1 卷柏炭的制備

參照文獻(xiàn)方法[6]，取潔凈的卷柏，置鍋內(nèi)用武火炒至外表焦黑色，內(nèi)呈焦黃色，噴淋清水，取出，曬干。

1.3.2 兩種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)卷柏生品藥液的制備

將藥材洗凈，切成1 cm段，置烘箱中50 ℃干燥，稱量100 g。煎煮2次，第1次加10倍量水煮沸30 min，第2次加8倍量水煮沸20 min，合并煎液，過濾，濃縮成100 mL的藥液，即得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 g /m L藥液。另稱量50 g，同法制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 g/mL卷柏生品藥液。

1.3.3 兩種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)卷柏炭藥液的制備

取卷柏炭，稱量100 g。煎煮2次，第1次加10倍量水煮沸 30 min，第2次加8倍量水煮沸20 min,合并煎液，過濾，濃縮成100 mL的藥液，即得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 g/mL藥液。另稱量50 g，同法制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 g/mL卷柏炭藥液。

1.4 動(dòng)物分組與給藥

將50只小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、卷柏生品低劑量組、卷柏生品高劑量組、卷柏炭低劑量組和卷柏炭高劑量組5組，每組10只。各給藥組分別灌胃相應(yīng)藥液，給藥劑量為20 μL/g,連續(xù)給藥3 d，1 d 1次。生理鹽水組灌胃等體積的生理鹽水作為對(duì)照。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 出血時(shí)間

采用剪尾法[7]：末次給藥1 h后，將小鼠驅(qū)入固定器中，露鼠尾于外，用剪刀剪去尾尖約3 mm，血自行溢出時(shí)開始計(jì)時(shí)。每隔20 s用濾紙輕輕吸取血滴1次，至以濾紙吸時(shí)濾紙上沒有血滴產(chǎn)生為止，所歷時(shí)間為出血時(shí)間。

1.5.2 凝血時(shí)間

分別采用玻璃毛細(xì)管法[8-10]和玻片法[8-10]測定。玻璃毛細(xì)管法：末次給藥1h后，立刻以玻璃毛細(xì)管插入剛被剪尾處理的小鼠左眼內(nèi)眥球后靜脈叢，從血液流入玻璃毛細(xì)管內(nèi)開始計(jì)時(shí)，血液注滿后將玻璃毛細(xì)管平放于桌上 ，每隔 20 s折斷毛細(xì)管0.5 cm,并緩慢向左右拉開 ，觀察折斷面是否有血凝絲,至血凝絲出現(xiàn)為止,所歷時(shí)間即為凝血時(shí)間。玻片法：末次給藥1 h后，毛細(xì)管取血，將毛細(xì)管中的血液滴2滴于載玻片兩端，血滴直徑 5～6 mm，開始計(jì)時(shí)，每隔 20 s用清潔針頭輕挑血絲1次，觀察有無血絲挑起，至挑起血絲止，所歷時(shí)間即為凝血時(shí)間。另一滴血供復(fù)檢。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)(x)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示。均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布時(shí)進(jìn)行單因素方差分析，非正態(tài)分布進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。多組間比較用ANOVA分析，再用LSD進(jìn)行多組比較。以P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠出血時(shí)間對(duì)比

與生理鹽水組對(duì)比，卷柏生品高劑量組出血時(shí)間增加，卷柏炭高、低劑量組出血時(shí)間減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。卷柏炭高、低劑量組與生品相應(yīng)劑量組對(duì)比，出血時(shí)間明顯減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與卷柏炭低劑量組對(duì)比，高劑量組出血時(shí)間雖減少，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠出血時(shí)間對(duì)比n=10,x±s

注:與生理鹽水組對(duì)比，**P<0.05，***P<0.01 ；與卷柏生品相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)組對(duì)比，##P<0.01；與卷柏炭高劑量組對(duì)比，△P>0.05。

2.2 各組小鼠凝血時(shí)間對(duì)比

玻璃毛細(xì)管法和玻片法測定結(jié)果一致：與生理鹽水組對(duì)比，卷柏生品高劑量組凝血時(shí)間延長，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與生理鹽水組、生品低劑量組對(duì)比，卷柏炭低劑量組凝血時(shí)間縮短，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與生理鹽水組、生品高劑量組對(duì)比，卷柏炭高劑量組凝血時(shí)間減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與卷柏炭低劑量組對(duì)比，高劑量組凝血時(shí)間有所減少，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。見表2、表3。

表2 玻璃毛細(xì)管法所測各組小鼠凝血時(shí)間對(duì)比n=10,x±s

注：與生理鹽水組對(duì)比，**P<0.05，***P<0.01；與卷柏生品相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)組對(duì)比，##P<0.05，###P<0.01；與卷柏炭高劑量組對(duì)比，△P>0.05。

表3 玻片法所測各組小鼠凝血時(shí)間對(duì)比n=10,x±s

注：與生理鹽水組對(duì)比，**P<0.05，***P<0.01；與卷柏生品相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)組對(duì)比， ##P<0.05 ###P<0.01；與卷柏炭高劑量組對(duì)比，△P>0.05。

3 討 論

出血是指因凝血系統(tǒng)障礙而發(fā)生的出血現(xiàn)象,為臨床的常見癥狀，中醫(yī)較早稱之為“血癥”。止血中藥較多[11]，炭藥是其中的佼佼者，因中藥在制炭后常增加其收斂與吸附作用,有利于止血。卷柏,生則破血通經(jīng),炙則化瘀止血。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：卷柏生品水煎液能明顯延長小鼠的凝血時(shí)間和出血時(shí)間,具有抗凝血作用；而卷柏炭品能夠明顯縮短小鼠的凝血時(shí)間和出血時(shí)間。結(jié)果表明：卷柏炒炭后確實(shí)有明顯的止血作用。本實(shí)驗(yàn)中玻璃毛細(xì)管法所測凝血時(shí)間與玻片法所測凝血時(shí)間基本一致,說明該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠、可信。此外，盡管沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差別，但卷柏炭高劑量組比低劑量組凝血用時(shí)短，表現(xiàn)出更強(qiáng)的促凝效果，與生理鹽水組和同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的卷柏生品相比，差異更顯著，說明在一定濃度范圍內(nèi)，藥液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)卷柏的促凝血活性有一定影響。

制炭為我國傳統(tǒng)的炮制工藝, 炭藥可增強(qiáng)收斂、止血之功,可降低毒性、緩和藥性等，其止血的機(jī)制非常復(fù)雜,往往并非由單一因素發(fā)揮作用的,主要是通過抑制抗凝血因子的產(chǎn)生或者增強(qiáng)體內(nèi)凝血因素而促進(jìn)凝血[12]?；鲋寡克幹饕糜陴鲅铚?、血不循經(jīng)而外溢的各種出血癥，卷柏炭作為臨床常用的化瘀止血炭藥炒炭后止血效果增強(qiáng)，其化學(xué)成分的種類、數(shù)量，與止血相關(guān)的藥性、藥效及臨床應(yīng)用和各個(gè)藥理環(huán)節(jié)也發(fā)生了不同程度的改變[13]。

為了能更正確地運(yùn)用炮制技術(shù)、規(guī)范飲片質(zhì)量、指導(dǎo)臨床用藥和新藥的開發(fā)[14-15]，需多學(xué)科多角度研究中藥炭藥止血的作用機(jī)制，對(duì)炭藥止血理論不斷加以充實(shí)、完善，以利于中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化，推動(dòng)中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，此是中藥現(xiàn)代化的發(fā)展趨勢[16]。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)12-0070-04

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.12.32

李根林，教授，河南中醫(yī)藥大學(xué)圖書館，lhb8899@163.com

金水區(qū)技術(shù)研究與開發(fā)經(jīng)費(fèi)支持項(xiàng)目[金科(2011)31號(hào) 項(xiàng)目序號(hào)：45]

2015-05-19；

2015-10-20