宋宏新, 黃滿紅, 杜枘宣, 薛海燕

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

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粗品肝素鈉制備工藝中酶解條件的研究

宋宏新, 黃滿紅, 杜枘宣, 薛海燕

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

為了研究胰蛋白酶在粗品肝素鈉制備中的酶解條件，通過效價測定，在料液比、酶解時間、酶解溫度、酶添加量、鹽濃度、酶解液pH 6個單因素實驗的基礎上，采用正交試驗設計來優(yōu)化工藝參數(shù).實驗結果表明，酶解的最佳條件為料液比1∶8，酶解時間3.5 h，酶解溫度60 ℃，酶添加量0.1%，鹽濃度0.5 mol/L，酶解液pH值為8.8.

肝素鈉； 胰蛋白酶酶解； 效價

0 引言

肝素是臨床使用最廣泛的抗凝血藥物，是由D-葡糖胺、L-艾杜糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺及D-葡糖醛酸交替組成的粘多糖硫酸酯[1]，主要存在于動物內臟中的肥大細胞顆粒中，多與蛋白質結合以蛋白質-肝素復合物存在，但以小腸粘膜、肺臟中含量最豐富，醫(yī)用肝素主要應用于抗凝血作用，屬生物制品，主要從牛肺和豬粘膜里面提取[2].在肝素鏈中存在一種獨特的五糖單位，可與抗凝血酶相互作用，幫助其實現(xiàn)抗凝血功能[3].

肝素雖在臨床使用有70余年的歷史，但到目前為止還沒有一種能完全替代它的產品，所以它仍然是目前最重要的抗凝血和抗血栓的生化藥物之一[4].此外，隨著研究的進展，發(fā)現(xiàn)肝素還具有澄清血漿脂質、降低血膽固醇和增強抗癌藥物等作用[5]以及抗炎、抗過敏、抗病毒等多種生物學功能[6].

Howell[7]在20世紀初美國生理雜志上最早發(fā)表了以狗內臟為原料的肝素提取技術.現(xiàn)行的肝素鈉提取技術大多基于將蛋白質-肝素復合物解離，再逐步純化游離的肝素鈉分子.我國企業(yè)現(xiàn)多采用鹽析法從豬小腸粘膜中提取肝素進行粗品肝素鈉的制備，但是此方法制得的肝素分子一般抗凝血活性普遍偏低，而且產品中雜質較多，產品色澤偏黃，無法達到FDA等國際藥典規(guī)定要求，針對這一問題，沈陽化工學院張萬忠[8]等對肝素鈉精制工藝進行了研究；陜西科技大學李紅心[9]對精品肝素鈉的制備及效價分析做了細致的研究.

胰蛋白酶可特異性切斷蛋白質-肝素的結合位點，從而使結合的肝素分子游離出來，同時影響肝素活性的雜蛋白等物質也可被蛋白酶分解為多肽，可通過調節(jié) pH、熱變性等方法在之后的步驟中除去.然而國內開展酶解法提取肝素的時間不長，得到的產品存在諸多問題，本文將從酶解工藝參數(shù)優(yōu)化等方面對肝素提取技術做相關研究.

1 材料與方法

1.1 材料

(1)新鮮豬小腸粘膜：購自西安市湖北莊市場的當天屠宰新鮮豬小腸，清洗食糜異物，再用剪刀剪成1.5～2.0米的小段，繼續(xù)清洗殘存食糜異物，然后再剪成20～30厘米的小段，再清洗，并用剪刀剖開清洗，而后將剖開的小腸用載玻片刮取上面的粘膜，制得新鮮豬小腸粘膜.

(2)胰蛋白酶(1∶250≥250 nfu/mg)：美國Sigma公司；肝素標準品(效價150 U/mg)：中國藥品生物制品檢定所；綿羊血漿：中國藥品生物制品檢定所.其它化學試劑為分析純.

1.2 實驗方法

(1)粗品肝素鈉制備工藝：

取一定量豬小腸粘膜，經胰蛋白酶酶解過濾后，濾液用D254樹脂[10]吸附，吸附后的樹脂用2.5 mol/L的NaCl溶液[11]洗滌，然后用4 mol/L的NaCl溶液[12]進行洗脫，洗脫液用95%乙醇[13]沉淀，再用丙酮洗滌、沉淀，進而在60 ℃烘箱中烘干[14]即得粗品肝素鈉.本實驗重點研究豬小腸粘膜的酶解條件.

(2)豬小腸粘膜的酶解：以一定的料液比向大燒杯中加入經斬拌機攪拌的小腸粘膜和蒸餾水，并且在一定的時間、溫度、酶添加量、鹽濃度、酶解液酸堿度下恒溫水浴.酶解完成后于90 ℃，5 min水浴滅酶活性，且有效殺滅有害細菌及微生物.收集酶解液，過濾后測定肝素鈉活性.放置4 ℃保存.

(3)肝素鈉效價測定：采用冷凍羊血漿法測定[15].估算待測樣品的效價，用0.15 mol/L的NaCI溶液稀釋至標準溶液(8 U/mL)相當?shù)男r濃度，根據綿羊血漿的半凝固點分別吸取樣品和標準品3到5個梯度，加1 mL綿羊血漿和0.02 mol/L的CaCl2溶液0.8 mL，置于37土0.5 ℃水浴1 h，記錄每管凝結程度，按式(1)計算.

樣品的效價單位=(Vstd×Cstd×V)/(Vsam×Wsam)

(1)

式(1)中：Vstd—標準品1/2凝固度的肝素加入體積(uL);Cstd—標準品溶液的濃度(U/mL);Vsam—樣品1/2凝固度的肝素加入體積(uL);Wsam—樣品稱取的重量(mg);V—測定樣品的總體積(mL).

(4)單因素實驗:單因素實驗在料液比(m/v)為1∶8、酶解時間為3.5 h、酶解溫度為60 ℃、酶添加量為0.1%、鹽濃度為0.5 mol/L、酶解液為pH 6的基礎實驗條件上，分別對6個單因素設置的各水平如下.

①料液比對肝素鈉效價影響實驗：設定小腸粘膜與蒸餾水的比(m/v)為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12；②酶解時間對肝素鈉效價影響實驗：選取2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、4.5 h；③酶解溫度對肝素鈉效價影響實驗：設置酶解溫度45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃；④酶添加量對肝素鈉效價影響實驗：選取酶添加量0.02%、0.04%、0.08%、0.1%、0.12%、0.14%；⑤鹽濃度對肝素鈉效價影響實驗：設置鹽濃度0.35 mol/L、0.4 mol/L、0.45 mol/L、0.5 mol/L、0.55 mol/L、0.6 mol/L；⑥酶解液PH值對肝素鈉效價影響試驗：設定酶解液pH值7、7.6、8.2、8.8、9.4、10.

各水平酶解后測肝素鈉效價.每水平重復3次,取平均值.

2 結果與討論

2.1 料液比與效價的關系

圖1為不同料液比對肝素鈉效價的影響.由圖1可知：當料液比較小時，因小腸粘膜黏稠度較大，不能充分地與酶液混合，導致酶解不充分，效價低.當達到料液比1∶8時，產品效價達到最高，料液比再增大時，由于水中溶解的雜質蛋白或其他大分子干擾了酶解效果，導致活性較低.因此選擇料液比1∶8為最佳條件進行下一步實驗.

圖1 酶解料液比對肝素效價的影響

2.2 酶解時間與效價的關系

圖2為不同酶解時間對肝素鈉效價的影響.從圖2可以得知：在一定范圍內酶解程度隨時間增加而增大，這是因為胰蛋白酶將與蛋白質緊密結合的肝素鈉大分子裂解下來，但是到達一定時間段后，肝素鈉活性卻下降，這可能是因為時間過長導致肝素分子構型或結構遭到破壞，或者是因為在60 ℃條件下微生物的大量繁殖造成肝素的破壞，也有可能是因為細胞內自身存在的肝素酶作用導致肝素的裂解.所以確定酶解時間在3～4小時范圍內最合適.

圖2 酶解時間對肝素效價的影響

2.3 酶解溫度與效價的關系

圖3為不同酶解溫度對肝素鈉效價的影響.從圖3可知：在一定范圍內酶解效率隨溫度升高，酶活性增強，但是當溫度超過60 ℃時，胰蛋白酶部分變性，不再是最適溫度，從而降低了酶活力而導致蛋白質-肝素復合物未能充分解離，因而降低了酶解液中肝素鈉活性.再者，溫度過高會使肝素鈉大分子中N-硫酸基團水解失活，也可造成效價下降，影響產品質量.所以確定最佳酶解溫度在55 ℃～65 ℃之間.

圖3 酶解溫度對肝素效價的影響

2.4 酶添加量與效價的關系

圖4為不同酶添加量對肝素鈉效價的影響.由圖4可明顯觀察到當酶添加量在0.04%時，由于濃度過低，達不到完全活性，不能將蛋白質充分解離而釋放出肝素鈉大分子.隨酶添加量升高，效價也有所提高，在酶添加量為0.1%時，解離出的肝素鈉活性達到最高，繼續(xù)增大添加量時，效價有所降低，這是因為過量的蛋白酶會使肝素水解.綜上以酶添加量0.1%作為最佳條件.

圖4 酶添加量對肝素效價的影響

2.5 酶解液中鹽濃度與效價的關系

圖5為不同鹽濃度對肝素鈉效價的影響.由圖5分析可知：鹽濃度在0.5 mol/L時效價達到最高，濃度過低無法將肝素大分子充分溶解導致效價過低，濃度過高抑制了胰蛋白酶的活性且會使肝素分子溶解度降低導致效價也不高.所以選擇0.5 mol/L為最佳條件.

圖5 酶解鹽濃度對肝素效價的影響

2.6 酶解液PH與效價的關系

圖6為不同酶解液pH對肝素鈉效價的影響.由圖6可知：當酶解液偏中性時，酶活力較低，在pH7～9時隨堿性增加胰蛋白酶達到最適酸堿度，在pH8.8時活力最高.但隨著堿性繼續(xù)增加，超過胰蛋白酶最適pH，則使酶失活，從而使其酶解效率下降，最終確定了酶解液pH為8.8.

圖6 酶解pH對肝素效價的影響

2.7 正交實驗

胰蛋白酶酶解蛋白質-肝素鈉復合物工藝條件的優(yōu)化：由上述單因素實驗可以明顯看出一般影響酶解后肝素鈉效價的顯著因素主要有以下三個：酶解時間、溫度和酶添加量.本實驗就以這三個因素為主要因素，分別取三個不同的水平，以肝素鈉效價Y(U/mg)為評價指標，選用L9(34)正交表安排實驗.

表1 酶解條件正交表

由正交表分析可得：肝素鈉的酶解實驗中，酶解時間、溫度及胰蛋白酶的添加量按影響肝素活性的大小來分：時間>溫度>酶添加量.并且選擇出了三者的最佳配比：酶解時間3.5小時、溫度60 ℃、酶添加量為0.1%.此外加之其他三個因素對于肝素鈉酶解結果的影響，得出以下結論：以料液比1∶8、酶解時間3.5 h、酶解溫度60 ℃、酶添加量0.1%、鹽濃度0.5 mol/L、酶解液pH值為8.8為酶解肝素鈉實驗的最佳條件.

3 結論

本研究從料液比、酶解時間、酶解溫度、酶添加量、鹽濃度、酶解液pH六方面考察了其對酶解效果的影響，并以酶解時間、酶解溫度、酶添加量對該酶解條件進行優(yōu)化，最終得出料液比1∶8、酶解時間3.5小時、酶解溫度60 ℃、酶添加量0.1%、鹽濃度0.5 mol/L、酶解液pH8.8為酶解肝素鈉實驗的最佳條件.

由于肝素鈉在動物組織中與蛋白以共價鍵的形式結合，需要在堿性條件下才能使其解離下來，酶解是使和肝素結合在一起的蛋白變成小分子的多肽，從而更容易與肝素分離，提取之前若將新鮮的腸粘膜變性則不但有助于蛋白的酶解,而且也可使體系中的肝素酶失活，防止在溫和的酶解條件下肝素酶分解破壞肝素.所以，在酶解前可先使腸粘膜變性以更好地保護肝素的結構不被破壞，提高其效價.

酶解的效率不僅與溫度、pH、酶量、時間有關，而且與酶和底物的接觸面積有關，該實驗中豬小腸粘膜的黏稠度較大，會直接影響酶與腸粘膜的接觸面積，進而影響酶解效果，所以可通過降低腸粘膜的黏稠度來增加酶與之的接觸,使其充分酶解，提高酶解效率和效價.

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Study on the enzymatic hydrolysis conditionsof the preparation for crude heparin sodium

SONG Hong-xin, HUANG Man-hong, DU Rui-xuan, XUE Hai-yan

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

To explore the best enzymatic hydrolysis conditions of heparin sodium,on the base of liquid ratio,hydrolysis time,hydrolysis temperature,enzyme dosage,salt concentration and enzymatic value of solution by potency determination and orthogonal test design to optimize the process parameters.The results indicate that liquid ratio of 1∶8,hydrolysis time 3.5 h,hydrolysis temperature 60 ℃,enzyme dosage of 0.1%,salt concentration 0.5 mol/L,enzymatic value of solution pH8.8 are the best conditions of the experiment on hydrolyzing the heparin sodium with trypsin.

heparin sodium; enzymatic hydrolysis with trypsin; potency

2015-03-10

西安市科技計劃項目(CXY1348)

宋宏新(1959-)，男，陜西興平人，教授，研究方向：生物活性物質的分離制備與檢測

1000-5811(2015)03-0121-04

Q538

A