李少英 何文智 劉海波 冼嘉嘉 馬曉燕 王曉蔓 黎青

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 婦產(chǎn)科研究所實(shí)驗(yàn)部，廣東 廣州 510150)

基因測序結(jié)合STR連鎖分析在假肥大型肌營養(yǎng)不良癥產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

李少英 何文智 劉海波 冼嘉嘉 馬曉燕 王曉蔓 黎青*

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 婦產(chǎn)科研究所實(shí)驗(yàn)部，廣東 廣州 510150)

目的 假肥大型肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne/Becker muscular dystrophy (DMD/BMD)是一種X-連鎖隱性致死性遺傳病，尚無特異性治療方法，建立一套適合于DMD基因點(diǎn)突變產(chǎn)前診斷及早期產(chǎn)前診斷的方法，為攜帶者產(chǎn)前診斷提供有效的基因診斷途徑，以避免患胎的出生。方法 27例DMD基因點(diǎn)突變攜帶者妊娠期取絨毛組織或羊水進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)胎兒的DMD基因測序、DNA-STR分型和性別基因檢測。結(jié)果 27個風(fēng)險(xiǎn)胎兒中，檢出DMD患胎6例,其中無義突變3例,移碼突變2例, 剪接位點(diǎn)突變1例；檢出攜帶者胎兒8例，其中移碼突變4例,無義突變3例，剪接位點(diǎn)突變1例；13例為正常胎兒。27例中11例是通過絨毛膜穿刺活檢進(jìn)行，其余為羊膜腔穿刺羊水檢查。結(jié)論 基因測序結(jié)合STR連鎖分析用于用于DMD點(diǎn)突變的產(chǎn)前基因診斷是目前一種準(zhǔn)確和可行的方法?？沙晒Φ乇苊饣疾√旱某錾?，并能明確區(qū)分DMD基因純合子和雜合子突變，避免正常胎兒被錯誤淘汰。

假性肥大型進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良癥抗肌萎縮蛋白；基因測序；產(chǎn)前診斷

假性肥大型進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne/Becker muscular dystrophy (DMD/BMD)是源于橫紋肌的一種X連鎖隱性致死性遺傳病,進(jìn)行性肌萎縮和腓腸肌無力伴小腿腓腸肌假性肥大是其典型的臨床特征，群體發(fā)病率高達(dá)1/3500[1]。本病定位在人類X染色體短臂Xp21上，DMD基因突變是假肥大型肌營養(yǎng)不良癥發(fā)病的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。迄今尚無有效的治療方法。其防治的基本措施是對DMD高危孕婦進(jìn)行胎兒產(chǎn)前基因診斷，避免有病患兒出生[2]。

我們采用基因測序方法對經(jīng)Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA)方法檢測后未檢測出DMD基因缺失和重復(fù)突變的患兒及家庭成員進(jìn)行DMD基因79個外顯子測序，并對檢出致病點(diǎn)突變的攜帶者孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷。為確保產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確率，我們采用基因測序結(jié)合STR連鎖分析對風(fēng)險(xiǎn)胎兒進(jìn)行診斷。本文是本院從2012～2014年間對25個DMD基因點(diǎn)突變家系的27個風(fēng)險(xiǎn)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷的結(jié)果。

1 資料與方法

1.1 基本資料 從2012～2014年，我們接受了27個假肥大型肌營養(yǎng)不良癥風(fēng)險(xiǎn)胎兒產(chǎn)前診斷，先證者主要來源于本院遺傳咨詢門診、中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院及廣州市兒童醫(yī)院等，先證者具有典型的臨床表現(xiàn)，經(jīng)血清肌酶、肌電圖或肌肉活檢等檢查，排除其他神經(jīng)肌肉系統(tǒng)遺傳病，并經(jīng)MLPA方法檢查后未發(fā)現(xiàn)有DMD基因79個外顯子中有缺失和重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 先證者及孕婦均經(jīng)本院基因診斷確診，明確先證者為DMD基因點(diǎn)突變，孕婦為攜帶者。

1.2.2 攜帶者再次生育時(shí)，于妊娠9～12周左右，經(jīng)常規(guī)術(shù)前檢查，在B超引導(dǎo)下，行絨毛膜穿刺術(shù)抽取絨毛組織約10 mg或于妊娠16周以后行羊膜腔穿刺術(shù)以獲得10 ml羊水樣本。

1.2.3 DNA的提取采用QIAmp DNA mini kit (QIAGEN, 德國)快速DNA提取試劑盒提取DNA樣本。

1.2.4 PCR反應(yīng)根據(jù)GenBank上DMD基因序列 NC_000023.9，用 Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增 DMD 基因單個外顯子的基因序列。引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成。PCR 反應(yīng)總?cè)莘e為 10 μl，每一反應(yīng)體系中含10 × PCR Buffer II 1.0 μl，3.2 μmol/L上下游引物各 1.0 μl，10 mmol/L的 dNTP 混合物 0.35 μl，5.6 units/μl的Taq DNA Polymerase 0.07 μl，模板 DNA 1.0 μl。反應(yīng)條件為 94 ℃ 12 分鐘(94 ℃ 30秒，52 ℃或 55 ℃30秒，72 ℃ 30秒)35 個循環(huán)；72 ℃延伸10分鐘；4 ℃保存。擴(kuò)增完成后取5.0 μl PCR 產(chǎn)物，DNA Marker 標(biāo)記，于2.0% 瓊脂糖凝膠，電壓 120V，電泳大約 30分鐘，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，若顯示各上樣孔擴(kuò)增條帶清晰，結(jié)果可靠，可用于基因測序檢測。

1.2.5DMD基因測序采用BigDye Terminator v3.1試劑盒進(jìn)測序，測序產(chǎn)物在ABI genetic analyzer 3500上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，電泳結(jié)束后使用 Sequencing Analysis 5.2 和 Mutation Surveyor 軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.6 STR連鎖分析選用DMD基因內(nèi)和兩側(cè)6個STR位點(diǎn)進(jìn)行分析，PCR體系、條件與引物參照http://www.DMD.CN/。

2 結(jié) 果

我們采用基因測序結(jié)合STR連鎖分析的方法對25個出現(xiàn)過先證者家庭的27例高風(fēng)險(xiǎn)妊娠于妊娠早期抽取胎兒絨毛組織，或妊娠中期行羊膜腔穿刺術(shù)抽取羊水作產(chǎn)前診斷。

2.1 25個產(chǎn)前診斷家庭中，DMD先證者基因突變類型無義突變10例，占40%；移碼突變9例，占36%；剪接位點(diǎn)突變5例，占20%；錯義突變1例，占4%(見表1)。

2.2 DMD產(chǎn)前診斷結(jié)果 27個風(fēng)險(xiǎn)胎兒中，男性胎兒13例，檢出DMD患胎6例，占46%(6/13)；女性胎兒14例，檢出攜帶者胎兒8例，占57%(8/14)，48%(13/27)為正常胎兒。27例中11例是通過絨毛膜穿刺活檢進(jìn)行，其余為羊膜腔穿刺羊水檢查。2.3 胎兒DMD基因突變類型 6例患胎中，無義突變3例，移碼突變2例，剪接位點(diǎn)突變1例；8例攜帶胎中，移碼突變4例,無義突變3例，剪接位點(diǎn)突變1例(見表1)。

表1 胎兒基因突變類型、臨床診斷及轉(zhuǎn)歸

注：a:胎兒樣本連鎖分析結(jié)果(DMD攜帶者)與測序結(jié)果(DMD患胎)不一致，在原檢測序序列兩側(cè)設(shè)計(jì)引物重新測序，結(jié)果顯示胎兒樣本在原引物序列位置中發(fā)生新突變(c.265-46G>GC)，新測序結(jié)果與連鎖分析結(jié)果一致。(見圖1)；b：胎兒樣本6個STR連鎖分析結(jié)果顯示在配子形成過程中在所選的STR位點(diǎn)中內(nèi)發(fā)生聯(lián)會交換。

3 討 論

DMD基因具有突變頻率高和突變形式多樣的特點(diǎn)。缺失突變、重復(fù)突變及點(diǎn)突變是DMD基因主要的突變類型，其中缺失突變，占55%～65%，重復(fù)突變占5%～10%，點(diǎn)突變占25%～30%左右[3]。目前，國內(nèi)常用的檢測DMD基因缺失/重復(fù)突變的技術(shù)有多重 PCR 技術(shù)、MLPA 技術(shù)、變性高效液相色譜技術(shù)(denaturing high performance liquidchromatography，DHPLC)等[4]。檢測DMD基因微小突變的技術(shù)有依賴于使用 RNA 的體外蛋白截短實(shí)驗(yàn)(protein truncation test，PTT)、編碼序列直接測序法、使用基因組的變性梯度凝膠電泳法(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strand conformation polymorphism，SSCP)、異源二聚體分析、變性高效液相色譜等方法，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但比較適合實(shí)驗(yàn)室使用的是直接測序法[4]。

圖1 2號樣本DMD基因第5外顯子測序結(jié)果

DMD基因產(chǎn)前診斷是一個比較復(fù)雜的難題，本院自1994年以來致力于DMD的研究，建立了一套DMD基因診斷和產(chǎn)前診斷技術(shù)，包括性別診斷、多重PCR缺失突變分析、直接測序、STR單體型連鎖分析。從2005年起，我們開展了MLPA方法同時(shí)診斷DMD基因79個外顯子的缺失突變與重復(fù)突變信息[5]；對于未能檢測出缺失突變與重復(fù)突變信息家系，如家系信息完整我們采用STR連鎖分析方法進(jìn)行產(chǎn)前診斷，但由于DMD基因龐大，在有絲分裂中基因內(nèi)發(fā)生重組的可能性約為10%，故在分子學(xué)水平運(yùn)用這種重復(fù)序列進(jìn)行連鎖分析的準(zhǔn)確性大概為95%[6-8]，如6號家系，胎兒樣本6個STR連鎖分析結(jié)果顯示在配子形成過程中在所選STR位點(diǎn)中內(nèi)發(fā)生聯(lián)會交換，只采用連鎖分析無法對這胎兒進(jìn)行診斷。

從2012年起，我們開展了直接測序方法診斷DMD基因79個外顯子的點(diǎn)突變信息，DMD基因總檢出率高于95%。并對檢出致病突變的攜帶者孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷。但只采用直接測序技術(shù)用于產(chǎn)前診斷有局限性。如2號家系(圖1)，胎兒樣本第一次測序結(jié)果顯示c.265 delG，符合進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良患者的基因特點(diǎn)，但通過STR連鎖分析和性別診斷結(jié)果顯示該胎兒為女性攜帶者，測序結(jié)果和連鎖分析結(jié)果不一致，考慮樣本基因在引物部位存在突變，因此在原檢測序列兩側(cè)設(shè)計(jì)引物重新測序，重新測序結(jié)果顯示，該序列同時(shí)存在兩個突變c.265-46G>C雜合子和c.265 delG雜合子，突變c.265-46G>C剛好在原測序引物的位置，新測序結(jié)果符合攜帶者的基因特點(diǎn)，與連鎖分析結(jié)果一致。同時(shí)對胎兒父母的該段序列測序，均無c.265-46G>C突變，但胎兒存在c.265-46G>C突變。因女性胎兒的兩條X染色體一般一條源于母親，一條源于父親，從圖1顯示胎兒的c.265 delG與c. 265-46G連鎖，源于母親，推測胎兒c.265-46G>C突變源于父親，該突變一種可能是精子減數(shù)分裂過程中偶發(fā)的新發(fā)突變，另一種可能源于父親生殖腺嵌合體。生殖腺嵌合體在多種遺傳病中均有報(bào)道，如進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良、巴特綜合征、致死性成骨不全等[9，10]。從上述例子顯示，只采用DMD基因測序手段進(jìn)行胎兒產(chǎn)前診斷會存在誤判的風(fēng)險(xiǎn)。我們對胎兒進(jìn)行DMD基因檢測的同時(shí)，選擇DMD基因內(nèi)和兩側(cè)的6個STR位點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析，從不同的角度考察含有突變的可能性，還可發(fā)現(xiàn)母體細(xì)胞污染問題。特別是在胎兒DMD基因型與母親基因型相同的情況下，DNA-STR分型顯得尤其有必要，可避免CVS取樣誤差導(dǎo)致的結(jié)果錯誤[11]，確保產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確率。

我們采用直接測序結(jié)合STR連鎖分析和性別基因檢測同時(shí)對27例胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷。檢出男胎13例，46%(6/13)為患胎；女胎14例，57%(8/14)為攜帶者；48%(13/27)為正常胎兒。建議患胎終止妊娠，正常及攜帶者繼續(xù)妊娠。其后進(jìn)行追蹤隨訪，均與診斷結(jié)果相符。

對家系中有先證者的高危孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷，可檢測出患胎、攜帶者和正常胎兒。避免了患胎的出生和健康男孩被不必要地淘汰。我們所推薦的直接測序結(jié)合STR連鎖分析和性別基因檢測的聯(lián)合方法，檢測結(jié)果快而準(zhǔn)確，同時(shí)我們提倡進(jìn)行絨毛活檢早期產(chǎn)前診斷以減輕孕婦身心痛苦。27例臨床DMD基因點(diǎn)突變風(fēng)險(xiǎn)胎兒診斷獲得了滿意的結(jié)果，取得了明顯的社會效益，對優(yōu)生優(yōu)育，提高人口素質(zhì)具有重要的意義。

[1] Fortina P, Cheng J, Mann A, et al. Diagnosis of Duchenne/Becker muscular dystrophy and quantitative identification of carrier status by use of entangled solution capillary electrophoresis[J]. Clin Chem,1997,43:745-751.

[2] 李濤，吳東，侯巧芳，等 MLPA聯(lián)合遺傳連鎖分析在假肥大型及肌營養(yǎng)癥產(chǎn)前診斷中的價(jià)值[J]. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2013,30(1)：40-44.

[3] Lee SH, Kwak IP, Cha KE, et al. Preimplantation diagnosis of non-deletion Duchenne muscular dystrophy (DMD) by linkage polymerase chain reaction analysis[J]. Mol Hum Reprod,1998,4(4):345-349.

[4] Shen BC. The analysis of Duchenne muscular dystrophy patients and carriers of the gene deletion, duplication and point mutation[M]. Guangzhou: Sun Yat-sen University, 2006.

[5] 李少英，孫筱放，黎青，等.中國人群中抗肌萎縮蛋白基因突變類型和分布特點(diǎn)及其與臨床癥狀相關(guān)性的研究[J]. 遺傳，2011,33(3):251-254.

[6] Beggs AH, Kunkel LM. A polymorphic CACA repeat in the 3’untranslated region of dystrophin[J]. Nucleic Acids Res,1990,18: 1931.

[7] Lee SH, Kwak IP, Cha KE, et al. Preimplantation diagnosis of non-deletion Duchenne muscular dystrophy (DMD) by linkage polymerase chain reaction analysis[J]. Mol Hum Reprod,1998, 4(4):345-349.

[8] Abbs S, Yau SC, Clark S, et al. Matthew CG and Bobrow M. A convenient multiplex PCR system for the detection of dystrophin gene deletions: compaoative analysis with cDNA hybridization shows mistypings by both methods[J]. J Med Genet,1991,28:304-311.

[9] Chang B,Momoi N, Shan L, et al. Gonadal mosaicism of a TAZ(G4.5)mutation in a Japanese family with Barth syndrome and left ventricular noncompaction[J]. Mol Genet Metab, 2010, 100(2):198-203.

[10] 段紅蕾，王皖駿，朱湘玉，等.連續(xù)發(fā)生兩次同種新發(fā)DMD基因突變的家系[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志[J].2015,32(4)：495-497.

[11] Winsor EJ, Akoury HD, Steele L, et al. The role of molecular microsatellite identity testing to detect sampling errors in prenatal diagnosis[J]. Prenat Diagn, 2010,30: 746-752.

編輯：宋文穎

Objective Duchenne/Becker muscular dystrophy (DMD/BMD) is an X-linked lethal recessive disease caused by mutations in the dystrophy gene. There is no specific and efficient treatment for this serious and disabling disease. We performed prenatal diagnosis for the carriers withDMDgene point mutations to early detection and prevent fatal birth defects in birth. Method Using DNA sequencing and linkage analysis of short tandem repeats (STR) methods, 27 cases which carryingDMDgene point mutations were performed prenatal diagnosis through amniocentesis or chorionic villus sampling. Results Within 27 cases of DMD risk fetus, 6 cases were found to be sufferer; in which 3 cases were Nonsense mutationhomozygote, 2 cases were Shift code mutations，1case was Splice site mutation. 8 cases were carrier, in which 4 cases were Shift code mutation heterozygote, 3 cases were Nonsense mutation heterozygote,1 case was Splice site mutation heterozygote.13 cases were normal. 16 cases were performed prenatal diagnosis through amniocentesis and 11 cases through chorionic villus sampling. Conclusions DNA sequencing combined with linkage analysis of short tandem repeats (STR) provides a accurate and available method forDMDpoint mutation in prenatal diagnosis. It can make a distinction betweenDMDgene homozygote and heterozygote, avoid misdiagnosis of normal male fetus.

Duchenne/Becker muscular dystrophy(DMD/BMD); dystrophy gene; DNA sequencing;prenatal diagnosis

10.13470/j.cnki.cjpd.2015.04.006

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B022000023)，廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201300000095)

*通訊作者：黎青，E-mail：81292522@163.com

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2015-11-08)