杜麗 王繼成 秦丹卿 余麗華 袁騰龍 張艷霞 王奕霞 梁駒卿 尹愛華

(廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 511442)

泰國(guó)缺失型α地中海貧血的家系分析及產(chǎn)前診斷

杜麗 王繼成 秦丹卿 余麗華 袁騰龍 張艷霞 王奕霞 梁駒卿 尹愛華*

(廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 511442)

目的 對(duì)3個(gè)泰國(guó)缺失型α地中海貧血家系進(jìn)行分析及產(chǎn)前診斷。方法 采集家系成員外周血進(jìn)行血細(xì)胞分析及毛細(xì)管電泳血紅蛋白分析；采集外周血及羊水、絨毛采用裂隙聚合酶鏈反應(yīng)(Gap-PCR)以及PCR結(jié)合反向點(diǎn)雜交(PCR-RDB)方法進(jìn)行常見6種α珠蛋白基因突變的鑒定；采用裂隙聚合酶鏈反應(yīng)(Gap-PCR)方法進(jìn)行泰國(guó)缺失型α地貧和菲律賓缺失型α地貧基因檢測(cè)。結(jié)果 在3個(gè)家系中檢測(cè)到2例泰國(guó)缺失型α地中海貧血攜帶者(—THAI/αα)及1例泰國(guó)缺失型復(fù)合4.2缺失型α珠蛋白基因缺失導(dǎo)致的血紅蛋白H病(—THAI/-α4.2)，并對(duì)3個(gè)家系進(jìn)行了產(chǎn)前診斷，檢測(cè)到2個(gè)胎兒為泰國(guó)缺失型α地中海貧血攜帶者(—THAI/αα)。結(jié)論 MCV降低、Hb A2降低而常規(guī)α地貧基因檢測(cè)未見異常的人群，尤其是有水腫胎生育史的家庭需要引起臨床醫(yī)生的重視，要考慮到罕見缺失型α地中海貧血，對(duì)于常規(guī)檢測(cè)提示為-α3.7或-α4.2純合缺失而地貧篩查可疑HbH病者也要考慮罕見缺失型α地中海貧血的可能性，對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)家庭要進(jìn)行產(chǎn)前診斷對(duì)于優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義。

泰國(guó)缺失型α地中海貧； 基因診斷； 產(chǎn)前診斷

地中海貧血(Thalassemia)是我國(guó)南方地區(qū)最常見的單基因遺傳病，主要分為α地貧和β地貧。廣東省生育人群α地貧的基因攜帶率為13.31%，β地貧的基因攜帶率為4.53%[1]。α地中海貧血主要由α珠蛋白基因缺失引起，我國(guó)常見的α地貧基因缺失類型主要為—SEA、-α3.7、-α4.2，基因攜帶頻率分別為6.85%、3.68%和1.27%，除此之外—THAI也是我國(guó)南方人群存在的缺失類型[2-5]。重型α地貧胎兒，又稱 Bart's水腫胎，多于懷孕晚期死于宮內(nèi)，即使能懷孕至足月，也多于出生后數(shù)分鐘內(nèi)死亡，而且孕婦常合并妊高征、胎盤早剝和子癇抽搐，產(chǎn)時(shí)或產(chǎn)后大出血等產(chǎn)科危重并發(fā)癥。Bart's水腫胎多數(shù)是由于東南亞型α基因純合缺失(—SEA/—SEA)引起，而東南亞型α基因缺失(—SEA)復(fù)合泰國(guó)型α基因缺失(—THAI)也可以導(dǎo)致水腫胎，且胎兒水腫的表現(xiàn)可能會(huì)更早[6，7]。我們對(duì)3個(gè)泰國(guó)型缺失α地中海貧血家系進(jìn)行分析，并進(jìn)行了產(chǎn)前診斷，報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 2013年1月至2014年12月在本院醫(yī)學(xué)遺傳中心就診并進(jìn)行產(chǎn)前診斷的3個(gè)家系。

1.1.1 家系1 孕婦就診時(shí)孕11+周，G3P1A1，2012年孕23+周因“胎兒水腫、胎死宮內(nèi)”引產(chǎn)一胎，要求進(jìn)行產(chǎn)前診斷。孕婦本人地貧基因診斷為：α地中海貧血，基因型為—SEA/α α，丈夫α地貧基因常規(guī)檢測(cè)未見異常，隨后其丈夫進(jìn)行泰國(guó)型基因缺失和菲律賓型基因缺失進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其丈夫明確診斷后絨毛穿刺進(jìn)行地貧產(chǎn)前基因診斷。

1.1.2 家系2 孕婦就診時(shí)孕17+周，G1P0，外院進(jìn)行地貧篩查可疑夫妻雙方地貧，要求進(jìn)行進(jìn)一步檢查。孕婦常規(guī)地貧基因診斷為-α4.2純合缺失，與篩查結(jié)果(可疑Hb H病)不符合，遂進(jìn)一步進(jìn)行泰國(guó)型基因缺失和菲律賓型基因缺失檢測(cè)，診斷為—THAI/-α4.2(Hb H病)，孕婦丈夫基因診斷為輕型α地中海貧血，基因型為—SEA/α α，對(duì)夫婦明確診斷后羊水穿刺進(jìn)行地貧產(chǎn)前基因診斷。

1.1.3 家系3 孕婦就診時(shí)孕16+周，G3P0A2，自述分別于2010年、2012年孕6+月因“胎兒水腫”引產(chǎn)，要求進(jìn)行產(chǎn)前診斷。孕婦本人基因診斷為輕型α地中海貧血，基因型為—SEA/α α，孕婦丈夫地貧篩查可疑α地貧基因未見異常，隨后其丈夫進(jìn)行泰國(guó)型基因缺失和菲律賓型基因缺失進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其丈夫明確診斷后羊水穿刺進(jìn)行地貧產(chǎn)前基因診斷。

1.2 方法

1.2.1 血液學(xué)分析 EDTA抗凝管采集3家系成員外周血2 ml，采用邁瑞2000血液分析儀進(jìn)行紅細(xì)胞參數(shù)分析。ACD抗凝管采集該3家系成員外周血2 ml，采用Sebia capillary2進(jìn)行血紅蛋白分析。

1.2.2 分子診斷

1.2.2.1 DNA提取 ACD抗凝管采集5家系成員外周血2 ml進(jìn)行α地貧基因診斷，無菌羊水管采集羊水15 ml或者絨毛6支進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷，DNA抽提試劑盒采用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒，按試劑盒說明書提取步驟進(jìn)行DNA的提取。應(yīng)用復(fù)合熒光標(biāo)記短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)方法排除羊水及絨毛樣本母體組織的污染[8]，排除母體組織污染之后才進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷。

1.2.2.2 α地貧基因檢測(cè) 采用單管四重PCR基因診斷技術(shù)檢測(cè)—SEA、-α3.7、-α4.23種α珠蛋白基因常見缺失型,采用裂隙聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合反向點(diǎn)雜交(PCR-RDB)方法進(jìn)行點(diǎn)突變的檢測(cè)，檢測(cè)范圍包括αCS、αQS、αWS3種點(diǎn)突變，基因診斷試劑由亞能生物技術(shù)有限公司(深圳)提供。

1.2.2.3 α地貧(—THAI/)和(—FIL/)缺失檢測(cè) 采用Gap-PCR方法檢測(cè)α地貧(—THAI/)和(—FIL/)缺失，引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[9]后自行設(shè)計(jì)，檢測(cè)(—THAI/)引物序列為THAI-F: GGCACTGAG-AGCCCTTCACG和THAI-R: CAAGTGGGCTGAGCCCTTGAG，檢測(cè)(—FIL/)引物序列為：FIL-F: TGCAAATATGTTTCTCTCATTCTGTG和ATAACCTTTATCTGCCACATGTAGC。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為1024 bp及1166 bp。內(nèi)對(duì)照α2基因擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1800 bp。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，PCR反應(yīng)體系購自大連寶生物工程有限公司。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5分鐘；95 ℃ 45秒→62 ℃ 60秒→72 ℃ 60秒，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7分鐘。

2 結(jié) 果

2.1 3家系成員的血液學(xué)指標(biāo)分析及基因診斷結(jié)果 在3對(duì)夫婦中共檢測(cè)到2例泰國(guó)型缺失α地中海貧血攜帶者(—THAI/αα)及1例泰國(guó)型缺失復(fù)合4.2型缺失導(dǎo)致的血紅蛋白H病(—THAI/-α4.2)。血細(xì)胞分析提示2例泰國(guó)型缺失地貧雜合子平均紅細(xì)胞容積(mean corpuscular volume，MCV)降低及血紅蛋白A2(Hb A2)降低，臨床表型與東南亞型缺失α地貧相似。1例泰國(guó)型基因缺失復(fù)合4.2型基因缺失(基因型：—THAI/-α4.2)導(dǎo)致的Hb H病臨床表型與東南亞型基因缺失復(fù)合4.2型基因缺失引起的Hb H病類似。3家系成員的血液學(xué)指標(biāo)分析及基因診斷結(jié)果、產(chǎn)前診斷結(jié)果詳見表1。3家系成員泰國(guó)缺失型α珠蛋白基因檢測(cè)瓊脂糖電泳圖分別見圖1、2、3。2.3 產(chǎn)前診斷結(jié)果及妊娠結(jié)局 在進(jìn)行產(chǎn)前診斷的這3個(gè)家系中，2個(gè)胎兒為泰國(guó)型缺失α地中海貧血攜帶者，經(jīng)過遺傳咨詢，均繼續(xù)妊娠。

表1 3家系成員血細(xì)胞分析、血紅蛋白分析及基因診斷結(jié)果

圖1 家系1父母及胎兒泰國(guó)缺失型α地貧檢測(cè)電泳圖

圖2 家系2父母及胎兒泰國(guó)缺失型α地貧檢測(cè)電泳圖

圖3 家系3父母及胎兒泰國(guó)缺失型α地貧檢測(cè)電泳圖

3 討 論

我國(guó)南方各省為地中海貧血高發(fā)區(qū)，廣東省育齡人群α地貧的基因攜帶率達(dá)到13%以上，α地貧的分子基礎(chǔ)主要是大片段基因缺失，—SEA,-α3.7和-α4.2為最常見的3 種基因缺失類型。隨著對(duì)地中海貧血認(rèn)識(shí)的增加，近年發(fā)現(xiàn)—THAI是我國(guó)南方地區(qū)僅次于常見3種缺失類型的一種α珠蛋白基因缺失[2-7]。泰國(guó)型α基因缺失與其他α地中海貧血復(fù)合存在，在臨床上可以形成中重型α地中海貧血，即泰國(guó)缺失型的Hb H病和泰國(guó)缺失型的巴氏水腫胎[5-7]。泰國(guó)型缺失α地中海貧血基因的缺失范圍包括人α珠蛋白基因簇中的多個(gè)基因，其缺失片段較東南亞型更大，包括ζ基因[10]，因此可能導(dǎo)致胎兒水腫的表現(xiàn)出現(xiàn)會(huì)更早[7]。

目前，常規(guī)α地中海貧血基因診斷只包括常見的3種基因缺失(—SEA/,-α3.7/，-α4.2/)和3種點(diǎn)突變(αCSα/，αQSα/，αWSα/)，尚未常規(guī)檢測(cè)泰國(guó)缺失型，因而容易造成誤診和漏診。因此，在地中海貧血基因診斷過程中，應(yīng)密切注意受檢者的表型、地貧篩查結(jié)果與基因型是否一致，在地貧篩查結(jié)果與地貧基因檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí)，要考慮是否存在罕見缺失型α地中海貧血，尤其是生育過水腫胎的病例。在我們?cè)\斷的這3個(gè)家系中，有2個(gè)家系有水腫胎引產(chǎn)史，夫妻雙方之一未明確α地貧基因攜帶情況。有1例泰國(guó)型基因缺失復(fù)合4.2型基因缺失(基因型：—THAI/-α4.2)導(dǎo)致的Hb H病，在外院只進(jìn)行了常規(guī)α基因診斷而誤診為-α4.2純合缺失(基因型：-α4.2/-α4.2)。在此，我們同時(shí)要強(qiáng)調(diào)在進(jìn)行地中海貧血基因診斷時(shí)，一定不能忽略地中海貧血的篩查。

我們通過對(duì)這3個(gè)家系的總結(jié)，豐富了罕見缺失型α地中海貧血的資料。泰國(guó)缺失型α地中海貧血的準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)于遺傳咨詢和產(chǎn)前基因診斷具有重要的意義。

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編輯：宋文穎

Objective Analysis and prenatal diagnosis to 3 families with THAI deletion α-thalassemia. Method The family members’ peripheral blood samples were analyzed by whole blood cell analysis and hemoglobin analysis with capillary zone electrophoresis (CZE), α hemoglobin gene mutations were analysis by Gap-PCR and polymerase chain reaction-reverse dot blot (PCR-RDB) assay for peripheral blood samples, amniotic fluid and chorionic villus samples. Results 2 carriers of THAI deletion α-thalassemia(—THAI/αα) and 1 case of hemoglobin H disease(—THAI/-α4.2) were detected. 2 of 3 fetuses were carriers of THAI deletion α-thalassemia(—THAI/αα). Conclusions Clinicians should pay close attention to those who could be carriers of THAI deletion α-thalassemia with reduced MCV and HbA2. Prenatal diagnosis should be performed in high-risk families which has the vital significance for eugenic birth.

THAI deletion α-thalassemia; gene diagnosis; prenatal diagnosis

10.13470/j.cnki.cjpd.2015.04.008

*通訊作者：尹愛華，E-mail：yinaiwa@vip.126.com

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2015-08-11)