王逾男 林建昌 張亮 何天文 劉暢 杜麗 尹愛華

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省婦兒醫(yī)院，廣東 廣州 511442)

懸浮陣列技術(shù)在地中海貧血基因診斷中的應(yīng)用

王逾男?林建昌?張亮 何天文 劉暢 杜麗 尹愛華*

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省婦兒醫(yī)院，廣東 廣州 511442)

目的 地中海貧血是由于α/β-珠蛋白基因突變或缺失導(dǎo)致的α/β鏈生成不足或完全缺如引起的以珠蛋白生成障礙為特點(diǎn)的遺傳性血液病。本研究旨在研發(fā)一個針對中國南方人群高發(fā)位點(diǎn)的地貧檢測平臺，并了解廣東省各地區(qū)地貧基因流行性情況。方法 基于懸浮陣列技術(shù)開發(fā)一個能同時檢測中國南方人群高發(fā)的20種地中海貧血點(diǎn)突變及3種缺失突變的平臺，利用200多例已知地貧基因型的樣本評估引物和探針的性能，以及確定突變位點(diǎn)檢測探針的截?cái)嘀?，并將此方法用于廣東省地貧防控項(xiàng)目中的81 052例標(biāo)本，以分析廣東省各地區(qū)地貧流行性現(xiàn)況。結(jié)果 本平臺使用的微球反應(yīng)面積大及探針數(shù)量多，加快了檢測速度，可同時檢測20種突變型地貧基因與3種缺失型地貧基因。廣東省地貧防控項(xiàng)目中的81 052例標(biāo)本中，共檢出12 296(15.20%)例攜帶地貧基因，其中8975 (11.07%)例攜帶α地貧基因，2857 (3.52%)例攜帶β地貧基因，464 (0.57%)例攜帶α地貧基因及β地貧基因。結(jié)論 懸浮陣列技術(shù)是一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的技術(shù)，尤其適用于大規(guī)模地貧基因診斷。

懸浮陣列技術(shù)；地中海貧血；點(diǎn)突變；缺失突變；分子診斷

地中海貧血(簡稱“地貧”)是由于α/β-珠蛋白基因突變或缺失導(dǎo)致的α/β鏈生成不足或完全缺如引起的以珠蛋白生成障礙為特點(diǎn)的遺傳性血液病[1]。地貧是全球分布最廣、累積人群最多的常染色體隱性遺傳病，約有占全世界人口5%的患者和攜帶者[2]，其中α地貧廣泛分布于廣大熱帶和亞熱帶地區(qū)，而β地貧高發(fā)于地中海沿岸國家和東南亞各國[3,4]。我國以南方地區(qū)多見，尤以廣東、廣西和海南為甚，以往研究表明，廣東省不同地區(qū)α地貧的攜帶率為5.2%～13.31%，β地貧的攜帶率為0.5%～4.53%[5]。α地貧大部分是由于位于16號染色體16p13.3的α珠蛋白基因大片段缺失引起的，少部分是由于點(diǎn)突變引起的。而β地貧主要是由位于11號染色體11p15.4的β-珠蛋白基因的點(diǎn)突變引起的，目前已發(fā)現(xiàn)了超過200種突變類型[6]。盡管地貧突變種類眾多，但突變類型有地域及種族特異性，且僅有少數(shù)幾種為常見突變。以往研究表明，我國南方人群有23種常見突變，占全部突變的98%以上，分別是-SEA、-α(3.7)、-α(4.2)、-29A>G、-28A>G、CAP+40-+43(-AAAC)、CD17A>T、CD26G>A、CD41-42(-TCTT)、IVS2-654C>T、αWS、αQS、αCS、CD27-28(+C)、IVS-1-1(G>T)、CD71-72(+A)、-32C>A、-30T>C、IntATG>AGG、CD14-15(+G)、IVS-1-5(G>C)、CD31(-C)和CD43G>T[5,7,8]。

由于我國南方地區(qū)地貧攜帶率高且無有效治療方法，因此在高發(fā)地區(qū)開展地貧篩查和產(chǎn)前診斷是預(yù)防重型患兒出生的重要措施。目前國際常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括血常規(guī)檢測分析紅細(xì)胞參數(shù)、血紅蛋白電泳、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)等定量分析血紅蛋白各組分含量以及地貧基因診斷。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因診斷技術(shù)已經(jīng)大量應(yīng)用于地貧的診斷。我國地貧的基因診斷始于20世紀(jì)80年代初，先后經(jīng)歷了DNA點(diǎn)雜交、限制性內(nèi)切酶酶譜分析、限制性片段長度(restriction fragment length polymorphism，RFLP)多態(tài)性連鎖分析、寡核苷酸探針雜交和跨越斷裂點(diǎn)的PCR技術(shù)(Gap-PCR)、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)及比較基因組雜交技術(shù)(array comparative genomic hybridization，aCGH)等[9-11]。其中Gap-PCR、MLPA及aCGH技術(shù)適用于缺失型α地貧的基因檢測。由于β地貧突變位點(diǎn)多樣，檢測金標(biāo)準(zhǔn)為DNA測序技術(shù)，但目前該技術(shù)價(jià)格昂貴且耗時耗力，其他的檢測技術(shù)包括反向斑點(diǎn)膜雜交(reverse dot-blot hybridization，RDB)、RFLP多態(tài)性連鎖分析等[12,13]。在眾多地貧的檢測平臺中，目前最常用的是串聯(lián)三級篩查法，即初篩為血常規(guī)檢查，MCV<82fl或MCH<27pg者行復(fù)篩血紅蛋白電泳檢查， HbA2<2.5者行α地貧基因檢查，HbA2>3.5者行α+β地貧基因檢查。而同時行α+β地貧基因檢查需分缺失型α地貧，非缺失型α地貧及β地貧檢測3次反應(yīng)進(jìn)行，費(fèi)時費(fèi)力，效率低，結(jié)果判讀不明確。

懸浮陣列技術(shù)較傳統(tǒng)的固相芯片的優(yōu)勢在于檢測通量大且速度快。由于微球直徑小，容易混懸在液體中，反應(yīng)接觸面積比固相芯片大，反應(yīng)快速、充分；液態(tài)芯片雜交發(fā)生在準(zhǔn)均相的液體環(huán)境中，在反應(yīng)中有利于生物大分子保持其正確空間構(gòu)象，使檢測結(jié)果穩(wěn)定?；谝陨蟽牲c(diǎn)，本方法也更適用于大樣本基因檢測[17]。目前，懸浮陣列技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因檢測，包括細(xì)胞因子檢測、囊胞性纖維癥篩查、HLA(human lymphocyte antigen)分類以及線粒體DNA突變檢測等[18-22]。故我們基于懸浮陣列技術(shù)平臺研發(fā)了一種能同時檢測中國南方人群高發(fā)的3種缺失型α地貧，3種點(diǎn)突變型α地貧及17種點(diǎn)突變型β地貧的檢測平臺(專利號：ZL201110301528.9)。

1 方 法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與標(biāo)本收集 本試驗(yàn)研發(fā)了一種基于懸浮陣列技術(shù)能同時檢測中國南方人群高發(fā)的20種點(diǎn)突變和3種缺失型突變的診斷平臺。研究獲得了廣東省婦幼保健院機(jī)構(gòu)審查委員會及廣州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。利用廣東省婦幼保健院生物樣品銀行中200多例已知地貧基因型的樣本評估引物和探針的性能，以及確定突變位點(diǎn)檢測探針的截?cái)嘀?cut-off value)。生物樣品銀行中所有樣品的采集、儲存和利用均遵循廣東省婦幼保健院機(jī)構(gòu)審查委員會及廣州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會制訂的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。所有樣品的采集均取得了參與者的書面知情同意書，且標(biāo)本在存儲與處理的過程中均匿名。臨床適用性的評估選用來自廣東省地貧防控流調(diào)項(xiàng)目中的81 052例標(biāo)本[5]。所有樣品的采集、儲存和利用均遵循廣東省婦幼保健院機(jī)構(gòu)審查委員會及廣州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會制訂的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。DNA的提取使用廈門至善生物DNA抽提試劑盒(至善生物，廈門，中國)，各操作步驟按說明書進(jìn)行。

1.2 探針與引物的設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)長度為20 bp的寡核苷酸捕獲探針檢測突變位點(diǎn)，在每個探針內(nèi)部設(shè)定特異序列以區(qū)分野生型探針及各突變探針。缺失型突變的檢測探針為長度40 bp的寡核苷酸探針且探針序列與-SEA,-3.7,-4.2序列高度匹配。利用探針5’端氨基化修飾共價(jià)耦合羧酸鹽微球。探針的具體信息如表1。為了達(dá)到最佳雜交反應(yīng)條件，點(diǎn)突變序列PCR產(chǎn)物均在300 bp左右。

共設(shè)計(jì)4對引物用于擴(kuò)增包含17種點(diǎn)突變的β珠蛋白基因序列，一對引物用于擴(kuò)增包含3種點(diǎn)突變的α珠蛋白基因序列。Gap-PCR用于檢測缺失型α地貧，引物設(shè)計(jì)跨越斷裂位點(diǎn)。

1.3 多重PCR與標(biāo)記 同一DNA樣本分兩管進(jìn)行擴(kuò)增。分別使用PCR mix A和PCR mix B。其中一管用于檢測3種缺失型α地貧(-SEA,-α(3.7),-α(4.2))，另一管用于檢測3種突變型α地貧及17種突變型β地貧。PCR體系為25 μl，包含0.2 mmol dNTPs，0.2 mmol Mg2+，1 U·TaqHS (TaKaRa, 大連, 中國)及25 ng DNA 樣本。突變型地貧PCR擴(kuò)增條件如表2，缺失型地貧PCR擴(kuò)增條件如表3，具體步驟按照說明書要求進(jìn)行操作。

1.4 探針與微球耦聯(lián) 參照說明書將設(shè)計(jì)的45組探針偶聯(lián)到不同熒光編碼的微球(Luminex Corp., Austin, TX, USA)上，混合耦聯(lián)好探針的微球，并懸浮于1ml PBS-T 緩沖液(Phosphate Buffered Saline with Tween-20, pH7.5)， 4 ℃避光保存。

1.5 雜交與分析 渦旋顛倒多重微球雜交液，使微珠充分重懸后，按每體積45 μl分裝至96孔反應(yīng)板中。每個樣品分別取2.5 μl A管產(chǎn)物和B管產(chǎn)物加之各反應(yīng)孔中，總體積為50 μl，充分混勻，封板膜密封后，按如下條件進(jìn)行雜交反應(yīng)：95 ℃變性5分鐘，迅速降至4 ℃。每個樣本取A管變性產(chǎn)物和B管變性產(chǎn)物各1 μl加至同一酶標(biāo)板反應(yīng)孔中，總體積50 μl，封板膜密封后，55 ℃雜交15分鐘。然后，每個反應(yīng)孔中加入100 μl預(yù)熱洗液終止反應(yīng)。每孔加入50 μl顯色工作液55 ℃顯色10分鐘。樣品采用Luminex 200系統(tǒng) (Luminex Corp., Austin, TX, USA)進(jìn)行分析。計(jì)算每個樣品的平均熒光強(qiáng)度(median fluorescence intensity，MFI)，當(dāng)樣品的平均熒光強(qiáng)度大于背景平均熒光強(qiáng)度10倍標(biāo)準(zhǔn)差以上時，代表特異的雜交信號。

表1 地貧懸浮陣列技術(shù)各探針序列

表2 突變型地貧PCR擴(kuò)增條件

表3 缺失型地貧PCR擴(kuò)增條件

1.6 結(jié)果判讀 同一突變位點(diǎn)檢測體系中分別包含野生型探針(N探針)及突變型探針(M探針)，突變型地貧基因型的判讀基于N/M比值。由于缺失型α地貧均發(fā)生在α2珠蛋白基因，故設(shè)置內(nèi)參照α2探針用于提示雜合或者野生型基因型。缺失位點(diǎn)檢測體系中包含缺失探針SEA, 缺失探針3.7，缺失探針4.2及野生型內(nèi)參照α2探針，基因型的判定取決于檢測探針的平均熒光強(qiáng)度(median fluorescence intensity,MFI)。

2 結(jié) 果

2.1 各位點(diǎn)檢測探針的截?cái)嘀档拇_定利用200多例已知地貧基因型的樣本來確定本平臺各位點(diǎn)檢測探針的截?cái)嘀?cut-off value)，采用N/M比值以及AUC法計(jì)算得到。共122份DNA樣品用于突變型位點(diǎn)檢測探針的截?cái)嘀档拇_立，基因型包括-29A>G、-28A>G、CAP+40-+43(-AAAC)、CD17A>T、CD26G>A、CD41-42(-TCTT)、IVS2-654C>T、αWS、αQS、αCS、CD27-28(+C)、IVS-1-1(G>T)、CD71-72(+A)、-32C>A、-30T>C、Int ATG>AGG、CD14-15(+G)、IVS-1-5(G>C)、CD31(-C)和CD43G>T。共78份DNA樣品用于缺失型α地貧的基因型確定，其中包括40份野生型及38份缺失型，缺失型DNA樣品基因型包括αα/-α(3.7)、αα/-α(4.2)、αα/-SEA、-SEA/-SEA、-SEA/-α(4.2)、-α(3.7)/-α(3.7) 和-α(4.2)/-α(3.7)7種。懸浮陣列技術(shù)檢測缺失型地貧的結(jié)果進(jìn)一步經(jīng)過了Gap-PCR的驗(yàn)證，如表4。

續(xù)表4

此外，表4為20種不同的點(diǎn)突變型α/β地貧及野生型標(biāo)本的地貧基因結(jié)果。表5為缺失型α地貧的MFI值。每個樣本重復(fù)檢測4次，取平均MFI值。以上數(shù)據(jù)表明，多重PCR結(jié)合懸浮陣列技術(shù)的用法用于檢測α/β-地貧是可行的。

表5 缺失型α地貧檢測MFI值

2.2 臨床驗(yàn)證 共有來自廣東省地貧防控的81052份臨床標(biāo)本用于地貧懸浮陣列技術(shù)的臨床驗(yàn)證。共檢出12296 (15.20%)例攜帶地貧基因，其中8975 (11.07%)例攜帶α地貧基因，2857 (3.520%)例攜帶β地貧基因，464 (0.57%)例攜帶α地貧基因及β地貧基因。地貧懸浮陣列技術(shù)檢出的基因型如表6。各基因型的頻率與以往中國南方人群的地貧基因頻率的報(bào)道是一致的[23, 24]。最常見的3種α地貧基因分別占總α地貧的比例分別為—SEA/αα(51.10%)、-α3.7/αα(25.10%)、-α4.2/αα(11.00%)，而87.01%的β地貧為β41-42/βA、β654/βA、β-28/βA和 β17/βA。為了進(jìn)一步驗(yàn)證本方法的有效性，隨機(jī)選取2%的野生型標(biāo)本和2%的突變型標(biāo)本，分別用gap-PCR檢測缺失型地貧及DNA測序技術(shù)檢測點(diǎn)突變型，結(jié)果完全與地貧懸浮陣列技術(shù)一致。

表6 廣東省地貧防控項(xiàng)目流調(diào)標(biāo)本檢測結(jié)果

續(xù)表6

續(xù)表6

3 討 論

目前廣泛用于臨床地貧檢測的方法由于耗時耗力已不適用于大樣本篩查[25]。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，比如基因芯片技術(shù)也已經(jīng)應(yīng)用于地貧的診斷中。生物芯片具有高通量、高集成、微型化、連續(xù)化和自動化等特點(diǎn)，可將α、β地貧診斷在一張芯片上完成，適用于大量人口篩查。生物芯片主要包括基因芯片和蛋白芯片兩大類，按尋址方式和最終檢測載體又可分為固相芯片(solid microarray)和懸浮陣列技術(shù)(suspension array)。盡管固相芯片對于小樣本量、多重位點(diǎn)的檢測，其靈敏度和特異度都較好，但由于反應(yīng)面積、空間效應(yīng)、表面張力等對反應(yīng)的干擾，其雜交動力反應(yīng)差。此外，固相芯片通量小，一次僅能檢測8個樣本。懸浮陣列技術(shù)與固相芯片相比，主要具有以下優(yōu)點(diǎn)：①懸浮陣列技術(shù)增加了雜交反應(yīng)面積，提高了檢測效能；②微球直徑小，容易混懸在液體中，且液體環(huán)境有利于分子間的相互作用，從而提高檢測速度；③克服了固相芯片在大分子檢測時受空間效應(yīng)、表面張力等對反應(yīng)的干擾，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性大大提高；④自動化程度高。懸浮陣列技術(shù)是一種以經(jīng)過特殊編碼、可識別的微球作為生物分子(抗原、抗體、蛋白質(zhì)、核酸等)反應(yīng)及信號檢測載體的陣列分析技術(shù)。迄今為止，懸浮陣列技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，如基因分型，細(xì)胞因子及甲狀腺激素的檢測，HLA分型(human lymphocyte antigen (HLA)，及自身免疫性疾病的診斷[26-29]。本實(shí)驗(yàn)組研發(fā)了一個能同時檢測缺失型和點(diǎn)突變型地貧基因的簡單易行的技術(shù)平臺。具有以下優(yōu)點(diǎn)：首先，本平臺理論上一次反應(yīng)可以檢測一百人份標(biāo)本，大大提高了檢測通量[30]；其次，本平臺使用的微球均有良好的生物相容性，穩(wěn)定性高，容易洗脫和分離；第三，懸浮陣列技術(shù)規(guī)避了固相芯片技術(shù)的缺點(diǎn)。探針與目標(biāo)分子混懸在液體中，有利于分子間的相互作用，提高了檢測速度及檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，使得本方法適用于大規(guī)模篩查。

地中海貧血是中國南方人群發(fā)病率最高，影響最大的單基因遺傳性疾病。了解廣東省各地區(qū)地中海貧血育齡夫婦患病現(xiàn)狀，有利于為高風(fēng)險(xiǎn)家庭提供遺傳咨詢和及早干預(yù)。本研究所使用的地貧基因懸浮陣列技術(shù)平臺可同時檢測20種突變型地貧基因與3種缺失型地貧基因，以往研究表明這23種常見突變占我國人群全部突變的98%以上。利用已知基因型的樣本對本實(shí)驗(yàn)的多重PCR反應(yīng)及雜交反條件應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。利用廣東省婦幼保健院生物樣品銀行中200多例已知地貧基因型的樣本評估引物和探針的性能，以及確定給突變位點(diǎn)檢測探針的截?cái)嘀?cut-off value)。地貧懸浮陣列技術(shù)的檢測結(jié)果與已知的地貧基因型是完全一致的，靈敏度和特異度均為100%，表明本方法臨床適用性良好。另外，由于本方法檢測通量高，平均每天可檢測800例標(biāo)本。本方法已用于檢測廣東省地中海貧血流行現(xiàn)狀基線調(diào)查中的81 052份標(biāo)本[5]。結(jié)果與以往報(bào)道基本一致，而大規(guī)模大樣本量的研究與科學(xué)的抽樣方法使得本研究結(jié)果更具有代表性以及更接近流行現(xiàn)狀。結(jié)果表明，東南亞型α地貧占全部α地貧的51.10%，最常見的β地貧是CD41-42(-TCTT)和 IVS2-654C>T，這兩種地貧加上CD17A>T、-28A>G、IVS-1-5(G>C)、IVS-1-1(G>T) 和 CD71-72(+A)占全部β地貧的90%以上。令人注意的是，有兩種β突變的(CD17A>T、CD41-42(-TCTT)發(fā)生率顯著高于以往報(bào)道，表明這兩種β地貧攜帶率近幾年可能有上升趨勢，此結(jié)論需在更大的樣本中驗(yàn)證。

雖然目前本平臺僅能檢測23種地貧基因，但基于其平臺優(yōu)勢，本方法也可擴(kuò)展到其他基因型的檢測。盡管β地貧基因突變類型有地域、種族特異性，目前已發(fā)現(xiàn)了超過250種突變。本平臺已囊括中國人群常見的β地貧基因位點(diǎn)，余位點(diǎn)也可設(shè)計(jì)檢測探針進(jìn)行檢測。例如，本實(shí)驗(yàn)中根據(jù)地中海貧血初步篩查血常規(guī)及血紅蛋白電泳結(jié)果提示有2例參與者可能攜帶相對罕見的致病基因。但由于本平臺未設(shè)計(jì)罕見地貧基因的檢測，故結(jié)果提示是陰性的?；诒酒脚_檢測常見突變的高靈敏度和特異度，我們推測這2例標(biāo)本所攜帶的致病基因未在檢測范圍內(nèi)，故我們利用DNA測序技術(shù)檢測到了相對罕見的致病基因rs111033605 和 rs34484056。據(jù)估計(jì)，這兩種突變類型的攜帶率為1%左右，所以我們決定在以后的平臺中引入這兩種突變類型的檢測。本方法展示了良好的多種基因突變檢測的可擴(kuò)展性。

傳統(tǒng)的地中海貧血基因的檢測需要分別用缺失型和突變型兩種商業(yè)試劑盒，成本相對較高。本平臺可在并行檢測缺失型和突變型地貧，可大大提高檢測量，減少周轉(zhuǎn)時間，節(jié)約人力資源及降低試劑盒與設(shè)備成本。

4 結(jié) 論

懸浮陣列技術(shù)是一種快速、準(zhǔn)確、自動及多重檢測技術(shù)。因本平臺可并行檢測3種缺失型和20種突變型α/β地貧，被認(rèn)為是適用于大規(guī)模地貧篩查的可靠的診斷技術(shù)。

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編輯：劉鄧浩

Objective Thalassemia is a group of inherited hematologic disorders caused by defects in the synthesis of one or more of the hemoglobin chains. The aim of this study was to develop an effective diagnostic platform for thalassemia targeting the hotspot mutation sites and deletion combinations, as well as to reveal theprevalence and molecular variation of α/β-globin gene mutations in Guangdong Province. Method We developed a new diagnostic assay using the bead-based suspension array technology (BBSAT), which can detect 20 point mutations and 3 deletions of Asian prevalent thalassemia in parallel within 5 hours. More than 200 previously genotyped clinical samples were used to determine the cut-off values and to validate the accuracy of new assay. Moreover, the new assay was applied to screen thalassemia in 40,813 clinical samples to investigate the prevalence and mutation spectrum of thalassemia in the population of Guangdong Province, China. Results In the BBSAT assay, suspended beads increase surface area to 3-D and more probes concentrated on beads. With the multiplex PCR primer and probe design strategy, both deletion mutations and point mutations of α/β thalassemia can be simultaneously detected in a single assay. Among 81,052 clinical samples, 12,296 samples carry thalassemia gene mutations, of which 8,975 samples (11.07%) carry α-thalassemia gene mutations, 2,857 samples (3.52%) carry β-thalassemia gene mutations, and 464 samples (0.57%) carry both α- and β-thalassemia gene mutations. Conclusions The BBSAT is a rapid, accurate and cost-effective technology, suitable for molecular diagnosis of the thalassemia in large populations.

bead-based suspension array technology (BBSAT); thalassemia; point and deletion mutation; moleculardiagnosis

10.13470/j.cnki.cjpd.2015.04.005

廣東省自然基金委(S2012010008318)

*通訊作者：尹愛華，E-mail：yinaiwa@vip.126.com

?:王逾男與林建昌為并列第一作者

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2015-09-15)